第8章 荧光免疫技术多媒体ppt课件.ppt

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1、第八章荧光免疫技术immunofluorecencetechnique荧光免疫技术荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光检测技术相结合而建立的一种标记免疫技术，具有高度的特异性、敏感性和直观性。荧光免疫技术的类型荧光抗体技术(fluorescenceantibaodytechnique,FAT)荧光免疫测定(fluorescenceimmunoassay)第一节概述荧光（fluorescence）荧光物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。一、荧光的基本知识荧光染料的特性激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)发射光谱是指固定

2、激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式:荧光效率=荧光的基本知识荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。荧光的基本知识荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。荧光的基本知识荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。二、荧光物质（一）荧光色素1.异硫氰酸荧光素（FITC）为

3、黄色或橙黄色结晶粉末，分子量为389.4，最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，是应用最广泛的荧光素。主要优点：①人眼对黄绿色较为敏感；②通常切片标本中的绿色荧光少于红色，降低背景干扰。2.四乙基罗丹明（RB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595－600nm，呈橘红色荧光。常用于双重标记或对比染色。3.四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较

4、低。4.藻红蛋白（PE）最大吸收波长为565nm，最大发射波长为578nm，产生橙红色荧光。在488nm处的光吸收率为565nm处的75％。与FITC一起用于双色免疫荧光染色。（二）其他荧光物质1.镧系稀土元素：某些三价镧系稀土元素如铕、钐、铽等的螯合物可发射特征性的荧光，其中铕的应用最广。铕螯合物激发光波长范围宽、发射光波长范围窄、荧光衰变时间长，最适于时间分辨荧光免疫测定。常用的荧光物质荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600

5、nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm575nm（红色）双标记FAT、流式细胞术Eu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定第二节荧光抗体技术荧光抗体技术的基本原理荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定，此技术亦称为荧光免疫组织化学技术（fluorescenceimmunohistochemi

6、strytechnique）。荧光抗体技术的内容荧光抗体制备标本制作荧光抗体染色荧光显微镜检查抗体要求高特异性高亲和力经纯化提取IgG一、荧光抗体的制备有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求荧光抗体的制备FITC的标记原理与方法荧光素-N=C=S+NH2-抗体荧光素-N-C-N-抗体HSH标记方法:搅拌法：适于标记体积较大、蛋白

7、含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体的纯化荧光抗体的制备荧光素与蛋白结合率：F/P=组化：F/P＝1.5活细胞染色：F/P＝２.４抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验荧光抗体的鉴定荧光抗体的制备-20℃：保存1～2年真空干燥：长