第8章 荧光免疫技术ppt课件.ppt

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1、第八章荧光免疫技术第一节概述一、荧光的基本知识二、荧光物质第二节荧光抗体技术一、荧光抗体的制备二、标本的制作三、荧光抗体染色与结果判断四、荧光显微镜的基本结构第三节荧光免疫分析的类型一、时间分辨荧光免疫测定二、荧光偏振免疫测定三、荧光酶免疫测定第四节荧光免疫技术在医学检验中的应用一、荧光抗体技术的应用二、荧光免疫测定的应用思考题小结第一节概述荧光（fluorescence）荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以波长大于激发光波长的发射光形式释放出能量，此发射光称为荧光。一、荧光的基本知识发射光谱和激发光谱发

2、射光谱：是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度，即荧光物质的发射光波长谱。激发光谱：是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度，即能激发荧光物质产生荧光的激发光波长谱。荧光的基本知识荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式:荧光效率=选择激发光波长在最接近于荧光物质的最大吸收峰处，而测定荧光波长设在接近于最大发射光波峰时，可得到最高的荧光效率。荧光的基本知识荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。激发光消失，荧光现象随之消失，但各种荧光物质的荧光寿

3、命不同。荧光的基本知识荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。（如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等）荧光淬灭是由于激发态电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。荧光的基本知识荧光偏振FH－FLP＝──────FH＋FL荧光的基本知识P：偏振度FH：激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度FL：上述两者方向互相垂直时测得的荧光强度当P=0时，说明完全不偏振；当P在-1至1之间，即为部分偏振荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)（应

4、用最广泛）490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT(淬灭速度慢)藻红蛋白（PE）565nm578nm（红色）双标记FAT、流式细胞术，可与FITC共用488nm激发光7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光物质：是一类能吸收激

5、发光的光能而发射荧光的物质。常用的荧光物质二、荧光物质此外，还有荧光底物，如4-甲基伞酮磷酸盐、4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷、对羟基苯乙酸。第二节荧光抗体技术（FluoresenceAntibodyTechnique,FAT）荧光抗体技术的基本原理荧光素标记抗体与切片中组织/细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。荧光抗体技术的内容荧光抗体制备标本制作荧光抗体染色荧光显微镜检查抗体要求高特异性高亲和力经纯化提取IgG(抗血清)一、荧光抗体的

6、制备有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求荧光抗体的制备抗体的荧光素标记标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法:搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：

7、适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。将装有待标记蛋白的透析袋放入含荧光素的buffer中。标记比较匀，非特异染色较低。荧光抗体的制备去除游离荧光素：透析或凝胶过滤（如G50，第1峰为结合峰，第2峰为荧光素峰）去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法（未结合荧光素的抗体荧光标记合适的抗体过量结合的抗体（阴离子较多），收集中间段）去除非特异反应抗体：动物肝粉吸收(最好是与试验标本同种的动物脏器)荧光抗体的纯化荧光抗体的制备荧光素与蛋白结合比率：荧光素（F）结合到蛋白（P）上的量。F/P=FITC标记的荧光抗体稀释至A280nm≈1.0

8、，分别测定A280nm（蛋白质特异吸收峰）和A495nm（标记荧光素FITC的特异吸收峰），F/P比值要适宜：组织切片用荧光抗体F/P=1.5，活细胞染色F/P=2.4为宜。抗体