第8章 荧光免疫技术多媒体解析ppt课件.ppt

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1、第八章荧光免疫技术第一节概述一、荧光的基本知识二、荧光物质第二节荧光抗体技术一、标本的制作二、荧光抗体的制备三、荧光抗体染色与结果判断四、荧光显微镜的基本结构第三节荧光免疫分析的类型一、时间分辨荧光免疫测定二、荧光偏振免疫测定三、荧光酶免疫测定第四节荧光免疫技术在医学检验中的应用一、荧光抗体技术的应用二、荧光免疫测定的应用思考题小结第一节概述荧光（fluorescence）荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。一、荧光的基本知识发射光谱和激发光谱发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下

2、记录的样品发射荧光的强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。荧光的基本知识荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率计算公式:荧光效率=荧光的基本知识荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。荧光的基本知识荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。荧光的基本知识荧光偏振FH－FLP＝──────FH＋FL荧光的基本知识荧光物质最大吸收光谱最大发射光

3、谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。

4、常用的荧光物质二、荧光物质第二节荧光抗体技术荧光抗体技术的基本原理荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。荧光抗体技术的内容荧光抗体制备标本制作荧光抗体染色荧光显微镜检查抗体要求高特异性高亲和力经纯化提取IgG一、荧光抗体的制备有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响

5、蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求荧光抗体的制备抗体的荧光素标记标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法:搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。荧光抗体的制备去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或

6、固相抗原吸收荧光抗体的纯化荧光抗体的制备荧光素与蛋白结合率：F/P=抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释荧光抗体的鉴定荧光抗体的制备-20℃：保存1～2年真空干燥：长期保存荧光抗体的保存荧光抗体的制备组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液培养细胞：单层培养细胞标本的类型二、标本的制作冷冻切片：操作简单，抗原损失少，组织细胞结构欠清晰。石蜡切片：组织细胞结构显现清楚，抗原损失多。组织切片的类型标本的制作固定剂：乙醇、甲醇、丙

7、酮、甲醛等保存：4℃、-20℃标本的固定和保存标本的制作直接法直接荧光抗体染色法示意图荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。三、荧光抗体染色及结果判断间接法特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。间接荧光抗体染色法示意图荧光抗体染色及结果判断双标记法两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。荧光抗体染色及结果判断设立实验对照:阳性对照和阴性对照区分特异和非特异染色阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色及结果判断“-”：无或仅见极微弱荧光。“+”

8、：荧光较弱但清楚可见。“++”：荧光明亮。“+++”：耀眼强荧光。特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“