荧光免疫技术ppt课件.ppt

《荧光免疫技术ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、荧光免疫技术ImmunofluorescenceTechnique目的与要求1.掌握荧光免疫技术的原理2.掌握荧光抗体技术(荧光抗体的制备、免疫荧光显微技术及在医学检验中的应用)3.熟悉有关荧光的基本知识4.熟悉荧光免疫技术的应用荧光免疫技术ImmunoflurescenceTechnique将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，从而对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的分析,这种免疫技术，称为荧光免疫技术免疫组化技术（荧光抗体技术）荧光免疫测定均相均相免疫测定（荧光偏振免疫测定）非均相

2、TR-FIA分类：分类：荧光免疫组化技术（荧光抗体技术）(荧光显微镜技术)荧光免疫测定均相均相免疫测定（荧光偏振免疫测定）非均相TR-FIA一、荧光现象化学物质释放能量：发光吸收能量激发态基态荧光特点：1)可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光2)一量停止供能，荧光随之瞬间消失种类：1.光致荧光2.化学荧光3.X线荧光第一节基本知识二、有关概念１、激发光与发射光激发光：物质分子成为激发态时所吸收的光发射光：处于激发态的分子回到基态时所产生的荧光2、发射光谱与激发光谱发射光谱fluorescencespectrum：固定激发光波长,化合

3、物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线激发光谱excitationspectrum：固定测量波长,化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线激发光400nm420nm-----E1440nm-----E2450nm-----E3500nm-----E4520nm-----E5560nm-----E6...320nmE1340nmE2350nm600nmE3370nmE4420nmE5450nmE6...测定光激发光测定光任何发荧光的物质分子都具有两个特征光谱--激发光谱和荧光发射光谱激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大3.

4、激发光谱与发射光谱的关系发射光谱的波长比激发光谱的长Stakes位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值荧光效率＝吸收光的光量子数（激发光强度）发射荧光的光量子数（荧光强度）激发光强度及激发光波长,测定光波长决定于荧光分子具有特定的吸收光谱及发射光谱：最大吸收峰最大发射峰４、荧光效率５、荧光的猝灭猝灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光长时间照射后会减弱猝灭剂：能引起荧光强度降低的物质如何避免：勿长时间照射脉冲瞬间照射避光保存二、荧光物质1、荧光色素：能产生明显荧光并能作染料使用的有机化合物２、常用荧光素异硫氰酸荧光素：(fluoresceinis

5、othiocyanate,FITC)四乙基罗丹明(Rhodamine,RB200)四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)异硫氰酸荧光素(FITC)四乙基罗丹明(RB200)最大吸收光波长490～495570550最大发射光波长520～530595～600620荧光颜色橘红色黄绿色橙红色３、其它荧光物质1)酶作用后产生荧光的物质：4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷4-甲基伞酮β-半乳糖苷酶2)镧系螯合物铕(Eu3+)、钐(Sm3+)、铽(Tb3+)等的

6、螯合物第二节荧光抗体技术（免疫荧光显微技术）一、荧光抗体的制备１、抗体要求：高特异性高亲和力高纯度２、荧光素要求⑴具有与蛋白质形成共价键的化学基团。荧光素-N=C+NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质‖︱︱‖︱SHHSH⑵荧光效率高，标记后下降不明显。⑶荧光色泽与背景色泽对比鲜明。⑷标记后能保持生物学活性和免疫活性⑸标记方法简单、快速。⑹安全无毒３、荧光抗体的制备将荧光素与特异性抗体以化学共价键结合而成(1)程序：制备免疫血清或McAb↓　　　抗体纯化　　　↓　　　抗体标记：搅拌法、透析法方法↓　　　标记物提纯：去除游离荧光素去除过

7、度标记或未结合抗体↓　　　标记物鉴定：含量、特异性、效价、F/P鉴定↓　　　实际应用１）搅拌法抗体溶液逐滴加入FITC溶液搅拌4～6h离心(2)荧光抗体制备方法搅拌法：适于体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液优点：标记时间短，荧光素用量少缺点：影响因素多易引起较强的非特异性荧光染色２）透析法FITC抗体溶液FITC标记的抗体溶液反应过夜PBS透析法：适于标记抗体量少，蛋白含量低的抗体溶液优点：标记比较均匀，非特异性荧光少缺点：所需荧光素量多，时间较长BACK(3)标记抗体的纯化1）去除游离的荧光素①透析法：②凝胶过滤：凝胶过滤2）去除过度标记

8、的蛋白质分子：离子交换层析：DEAE—纤维素过柱法(4)荧光抗体的鉴定1）F/P比值鉴定F/P比值：荧光色素与球蛋白的结合率测定方法：将制备的荧光抗体稀释至A280