免疫荧光技术课件.ppt

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1、免疫标记技术用可以微量检测的标记物（示踪物质）标记抗原或抗体，作为试剂，与相应抗体或抗原结合反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少。免疫标记技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性免疫标记技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术酶荧光素同位素常用标记物荧光素酶同位素胶体金可发光化学物质试验命名：根据标记物命名如：免疫荧光技术免疫酶技术等免疫荧光技术（Immunologicalfluorescenttechnique，IF)原理：用荧光素标记抗原或抗体，与待测标本中相应抗体或抗原结合，通过检测荧光，确定标本中

2、有无待测的抗体或抗原。免疫荧光技术分类：免疫荧光显微技术（定性）免疫荧光测定技术（定量）一.荧光、荧光素及荧光显微镜（一）荧光一种光照射某种物质时，该物质可发出比照射光波长更长的光称为荧光。照射光:可见光、紫外光(二）荧光素能产生荧光的物质，可作为染料。常用荧光素：1.异硫氰酸荧光黄(FITC)可发出黄绿色荧光2.四乙基罗丹明（RB200)发出橘红色荧光3.藻红蛋白（PE）发出橙色荧光（三）荧光显微镜1.结构：主要组成A.白炽光源（超高压汞灯）：发射紫外光或兰紫光；B.两组滤光板:激发滤板（选择合适的激发光谱）；抑制滤板（抑制紫外光或兰紫光进入视野，只允

3、许荧光通过。C.显微镜：普通的光学显微镜。光路程序：白炽光源——发射紫外光or兰紫光——激发滤板——紫外光——被检物（荧光染色标本）——紫外光＋荧光——抑制滤板——荧光（显微镜下可见）目镜阻挡滤镜载玻片荧光显微镜光路示意图光源隔热滤片激发滤片聚光器物镜荧光显微镜光路示意图荧光显微镜据光源路径分透射式（光源从下面经聚光器会聚后到达样品，适用于观察对光可透的标本）落射式（光源从上面到达样品，经标本反射进入物镜。适用于观察透明度不好的标本及各种活性组织等）2.使用注意事项：染色后立即检查（荧光易猝灭）准备好后开启白炽光源，不能随时启灭。打开后15分钟才能关闭每

4、次使用2小时保持室内通风荧光素可以标记（染色）抗原，也可以标记抗体标记抗原用得少标记抗体用得多一般免疫荧光显微技术均标记抗体二.免疫荧光显微技术（一）荧光抗体的制备（二）片子的制作（三）荧光抗体染色方法（一）荧光抗体的制备：纯化的一定量抗体加一定量FITC(搅拌使结合）去除游离荧光素测抗体效价、测荧光素与蛋白质（Ab）结合比（F/P）小量分装保存备用（二）片子的制作：1.常做切片、涂片、印片，要求薄、均匀，并与玻片充分固定。固定后不能被洗脱。2.注意保持抗原完整性3.不同材料固定方法不同（无水已醇、丙醇、聚甲醛等）（三）荧光抗体染色法1.直接法待测标本固

5、定（Ag？）+Ab快、直接、干扰因素少用于检测抗原每检测一种抗原需标记相应的荧光抗体,较麻烦洗涤，AgAb2.间接法分两步：第一步：荧光素标记抗抗体（如荧光标记的羊抗人IgG）；第二步：已知Ag固定＋待测标本（Ab？）——洗涤，＋荧光标记的抗抗体——洗涤，荧光显微镜镜检间接法用得最多优点：制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测灵敏度高3.补体法：第一步：荧光素标记抗补体；第二步：已知Ag固定＋待测标本（Ab？）＋补体——洗涤，＋荧光标记的抗补体——洗涤，荧光显微镜镜检特点：灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多种检测干扰因素多，补体不稳定，易失活，

6、该法少用4.双标记法用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体，对同一标本染色，当Ag有两种相应抗原表位存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光。（四）免疫荧光显微技术优缺点优点：1.特异性、敏感性高2.快速3.可定位4.既可测Ag又可测Ab缺点：1.需要荧光显微镜2.存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题）3.定性测定、判断结果不客观4.制备的片子难以长期保存（荧光猝灭）三.时间分辨荧光免疫测定（液相检测）原理：用铕(Eu)等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag，从而检测待测标本中相

7、应Ag或Ab的新技术。其特点是：利用时间分辨荧光仪延缓检测时间，排除非特异性干扰荧光。灵敏度可达0.2~1ng/ml。思考题：1.免疫标记技术的原理2.免疫荧光技术中最常用的荧光素是什么？3.免疫荧光显微染色的各种方法及优缺点免疫酶技术Immunoenzymetechnique概述：70年代初在免疫荧光技术基础上建立。较IF、RIA(radioimmunoassay)更优越,具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点原理：利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性，结合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产物，根据产物颜色深浅推测出

8、待测物中相应物质（Ab、Ag)有无及含量多少。Ag+AbEAgAbE+底物呈色反