第二章_DNA重组克隆的单元操作--目的基因的获取 吧ppt课件.ppt

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1、第三节目的基因的获取一、通过建立基因文库分离目的基因二、化学合成法制备DNA片段三、聚合酶链反应法扩增基因片段(PCR)1一、通过建立基因文库分离目的基因Genomiclibraries(基因组文库）cDNAlibraries（cDNA文库）基因文库(madefromgenomicDNA)(madefromcDNA-copyofmRNA)2将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的

2、全部基因，称为基因文库。（一）基因文库的构建1.基因文库（genelibrary）3Library质量的评价：（1）文库的代表性（Representativegenelibraries）（2）Gene片段的完整性文库的代表性:指genelibrary中包含的DNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性，它是体现文库质量的最重要指标。4（2）目前常用的载体2.构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的

3、重组子越少。（1）对载体的要求载体系列：容量为24kpCosmid载体：容量为50kbYAC：容量为1MbBAC:容量为300kb5断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）片段长度均一，大小可控，平头末端机械搅拌（8kb）①物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。②酶切法：6PartialRestrictionEndonucleaseDigestionofDN

4、As7PartialDigestionProfile利用restrictionenzyme的不同酶解时间、浓度处理后，收集目的基因的大小片段。分类和组合合适的目的基因片段。DNA8（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。9各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶

5、粘性末端③同聚物加尾10114.基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）12例如：人的基因组是3×109bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N

6、=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×10513从cDNAlibrary可以获得较完整的连续编码序列(不含intron）,便于表达成蛋白质。二、cDNA文库的构建141.cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2.cDNAlibrarymRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。15（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包

7、含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4.构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（totalRNA）提取3.cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。16分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化①原理②mRNA的分离纯化Column（柱）17MixunderhybridizationconditionsW

8、ashawayrRNAandtRNAElutecoluminlowsaltbuffer18反转录酶（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OligodT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物19用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’3’5’5’引物cDNA