医学遗传学基因诊断与治疗课件.ppt

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1、传统的诊断１、问、望、听、触…—经验型判断的方法。２、化验/检验——细胞、组织、大分子、小分子、酶、代谢物；微生物、免疫学、生物化学、病理学等。３、影像学—X线、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。４、特殊检查—染色体检查、肌电/脑电/心电、骨密度、原子吸收光谱等。随着技术水平的发展，这些诊断方法也在不断的提高和完善，在医学实践中发挥了巨大的作用。并还将有更先进的方法问世。但这些方法大多存在一个无法克服的缺陷：不可预先诊断。随着分子生物学和分子遗传学的发展，越来越多的证据表明，绝大多数疾病的发生和发

2、展都与患者的遗传物质结构和功能改变有关，所以遗传物质的检查越来越显得必要。基因诊断的定义应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构和功能变化而作出的或辅助临床诊断的技术，称为基因诊断。基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低，并对许多疾病特别是遗传性疾病做出预先诊断的优点。它是一种极具发展潜力的诊断方法。由于基因诊断发展的时间不长，人们对于基因，特别是致病基因的了解还有许多空白，因此许多疾病的诊断还主要依靠其他方法。此外，基因诊断的发展并非取代和抛弃其他方法，而是相互补充，共同发展。长期以来，单

3、基因遗传病的诊断主要靠临床观察和一系列生化检查，但生化学检查要求有相应基因表达产物的体液或细胞，并对基因产物或代谢异常机理有所了解。但对绝大多数遗传病而言，目前还远未达到这种认识。诊断方法的变更理想的诊断方法是对患者基因或DNA本身直接进行分析，因为这种分析摆脱了上述各种限制。机体各种组织的核细胞均有全套基因组DNA，可以作为分析的材料，而不必考虑表达问题，是目前诊断技术中最具发展前途的技术。基因诊断的对象1.病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病、支原体、细菌、寄生虫。2.先天遗传性疾患，如苯丙酮尿症

4、、无丙种球蛋白血症。3.后天基因突变引起的疾病，如肿瘤。4.其它，如亲子鉴定、个体识别、法医物证。基因诊断的内容与疾病相关的遗传物质改变主要有两类，1.遗传物质，即DNA或RNA的水平的变化。如病毒感染时病毒基因及其转录产物在人体内的从无到有，某些肿瘤中癌基因表达水平的从低到高。2.遗传物质的结构变化，即基因突变。如点突变引起的基因失活、染色体转位引起的基因激活或灭活等等。因此，从理论上说，所有涉及基因结构和功能变化的检测都属于基因诊断。基因诊断的原理核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。基

5、本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。进行基因检测有两个必要条件：一是必需的特异的DNA探针；二是必需的基因组DNA。当两者都变性呈单链状态时，就能进行分子杂交。基因探针基因探针（probe）就

6、是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。DNA探针根据其来源有3种：1、来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomicprobe）2、是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa探针（cDNaprobe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列3、可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针一、探针的来源：二、探针的制

7、备一般是通过分子克隆（molecularcloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。制备cDNA探针离

8、纯化相应mRNAmRNA模板cDNA人工合成寡核苷酸探针已知蛋白质的氨基酸顺序量按氨基酸的密码推导出核苷酸序列化学方法合成三、探针的标记为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用放射性同位素32P标记探针的某种核苷酸α磷酸基。近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体等作为标记物的方法。但都不及同位素敏感。5′3′5′3′最常用的探针标记法缺口平移法(nicktranslation)，5′3′5′3′DNA酶I5′3′5′3′O