EXP-血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳.ppt

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1、蛋白质名称PI泳动脉(cm2·V-1·S-1)血清蛋白浓度(10-2g.mL-1)分子量(Mr)占总蛋白含量(%)清蛋白4.64-5.9×10-54.06900056.70α1-球蛋白5.06-5.1×10-50.312000003.74α2-球蛋白5.06-4.1×10-50.483000007.65β-球蛋白5.12-2.8×10-50.819000-15000011.53γ-球蛋白6.35-7.30-1.0×10-50.71156000-30000020.30纤维蛋白元5.40-3.1×10-5表中国正常成人血清蛋

2、白质组成HOWTO获得血清？实验7血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳1目的■学习醋酸纤维薄膜电泳的操作；■了解电泳技术的一般原理。2原理►血清中含有多种蛋白质，它们之中有的和某些糖类结合，形成糖蛋白。由于各种蛋白所具有的解离基团不同，因而在同一pH溶液中，所带净电荷不同，因此在电场中移动速度不同，故可利用电泳的方法将它们分离。（celluloseacetatemembraneelectrophoresis）带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快任何一种物质的质点，由于其本身在溶液中的解离或由于其表面对其他带电质点的吸附，会在

3、电场中向一定的电极移动有此一问？Why选择pH8.6的巴比妥电极缓冲液？请你预测！本表中各蛋白组分的电泳图谱？蛋白质名称PI清蛋白4.64α1-球蛋白5.06α2-球蛋白5.06β-球蛋白5.12γ-球蛋白6.35-7.30pH选择多少呢？有什么规律让俺记住？一般在碱性溶液中（即溶液pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。移动的速度取决于带电的多少和分子的大小。泳动度不同质点在同一电场中的泳动速度不同，常用泳动度/迁移率来表示。泳动度指带电质点在单位电场强

4、度下的泳动速度vd/tdlu=——=—=—（cm2.V-1.S-1)EV/lVt影响泳动度因素带电质点的性质溶液的粘度电场强度溶液pH值溶液离子强度固体支持物电渗现象一般质点所带净电荷越多，质点D越小，越接近球形，则在电场中泳动速度越快反之则越慢●采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，称为醋酸纤维薄膜电泳。●醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120um，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。是纤维素的醋

5、酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度约0.1-0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎●目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白，糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中3实验材料、器具与药品人血清药品:醋酸纤维薄膜(2×8cm)常压电泳仪巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.07)染色液；含氨基黑10B0.25g/甲醇50mL/冰醋酸10mL/水40mL漂洗液：甲醇或乙醇45mL、冰醋酸5mL、水50mL4实验内容浸泡镊子取HAc

6、纤维薄膜2张(识别出光/无光泽面，在角上用笔做记号)放入buffer中浸泡20min练习点样If浸润迅速，色泽深浅一致→膜质地均匀If出现深浅不一的条纹/斑点→点样电泳染色漂洗取出膜条→夹在2层粗滤纸内吸干多余液体→平铺在玻板上(无光泽面朝上)→将点样器先在白磁板上血清中沾一下→在膜条一端2～3cm处轻轻地水平落下并随即提起→膜条上点上了细条状的血清样品电泳槽内加入buffer，等高膜条(Note:端？面？)平悬于电泳槽支架的滤纸桥上通电。140V0.5～0.8mA/cm膜宽实验的关键电泳仪上细调节旋扭调到每cm膜宽电流

7、强度为0.7mA(8片薄膜则为11.2mA)。电泳时间约50-80min这时做什么？细节！5.注意事项⑴醋酸纤维素薄膜的预处理薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15-30s时，膜片吸水不均匀，则有白色斑点或条纹，这提示膜片厚薄不均，应弃去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐

8、，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹污染，取膜时，应戴指套或用夹子。(2)加样量加样品量多少与电泳条件、样品性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。一般检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，电泳后区带分离不清楚，互相干扰，染色较费时点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，