实验四 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳

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1、celluloseacetatemembraneelectrophoresis实验四血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳7/29/20211【实验目的】掌握电泳法分离血清蛋白质的原理掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义7/29/20212电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术【实验原理】7/29/20213H＋OH－H＋OH－pH>pIpH=pIpH

2、介质的粘度7/29/20215影响电泳速度的因素1.样品本身：分子形状：形状越小，与支持物介质摩擦越小，u越大。球形分子>纤维状分子Q越多，u越大；分子小，r越小，u越大；7/29/202162.缓冲溶液：pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大离子强度(I)：I越大，电动电势越小，u越小；I越小，电动电势越大，u越大，但样品易扩散。离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.02～0.2之间。7/29/20217电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。3.电场强度(X)X越大，u越快。支持物越短，X越大，

3、u越快。电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离7/29/202184.支持介质：①纤维薄膜(玻璃纤维薄膜，醋酸纤维薄膜)②凝胶(琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶)7/29/20219负极正极－－－－－－－－表面带负电荷带正电荷的水层携带粒子向负极移动如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。电渗作用：电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。＋＋＋＋＋＋＋＋以纸电泳为例:7/29/202110区带电泳的分类（一）支持物物理性状1．

4、滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤维薄膜)电泳2．粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；3．凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳；4．丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。7/29/202111（二）支持物装置形式：1．平板式电泳：支持物水平放置；2．垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；3．垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳7/29/202112(三)pH连续性：1．连续pH电泳：即整个电泳过程pH保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。2．非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉，等电聚焦电泳等7/29/202113醋

5、酸纤维薄膜为支持物pH=8.6的巴比妥缓冲液血清蛋白的pI均小于8.6负电荷电泳时向正极移动由于迁移率不同而被分离7/29/202114γβα2α1清蛋白分子越小，泳动速度越快带电量越多，泳动速度越快7/29/202115膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带。2.定性,定量各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。7/29/202116醋酸纤维薄膜：醋酸纤维加工的细密且薄的微孔膜广泛应用医学临床各种生物分子的分离分析血清蛋白、血红蛋白、球蛋白脂蛋白、糖蛋白甲胎蛋白、类固醇及同工酶等7/29/202117优点：简单

6、快速缺点分辨率较低（聚丙烯酰胺凝胶电泳，PAGE）不适于制备（薄膜厚度约10～100μm，样品用量很少）7/29/202118【器材及试剂】1、器材：醋酸纤维薄膜（2×8cm）常压电泳仪竹镊点样器人血清或鸡血清粗滤纸2、试剂：巴比妥缓冲液氨基黑10B0.25染色液漂洗液透明液7/29/202119[操作]（一）仪器与薄膜的准备1、醋酸纤维素薄膜的润湿与选择2.电泳槽的准备3、电极槽的平衡7/29/202120（二）点样取出薄膜，无光泽面向上平放在滤纸上点样区距阴极端1.5cm血清均匀涂在点样器表面将点样器轻轻印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内形成一定宽度、粗细均匀的直线实验的关键，

7、是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节7/29/202121（三）电泳点样端薄膜平贴阴极电泳槽支架滤纸桥(点样面朝下)另一端平贴在阳极端支架要求：薄膜紧贴滤纸桥并绷直，薄膜之间相隔几毫米盖电泳槽盖，平衡10min打开电源开关，调节电流强度为0.3mA/片，通电10min调节电流强度为0.5mA/片，电泳60~90min电泳后调节旋钮电流为O，关闭电泳仪切断电源7/29/202122DYY-5型稳压稳流电泳仪DYY-Ⅲ型电泳槽7/29/2021237/29/