角倍蚜总RNA提取方法的比较及优化.pdf

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1、山西大学学报（自然科学版）３４（Ｓ２）：１０４～１０７，２０１１ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｈａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）文章编号：０２５３－２３９５（２０１１）Ｓ２－０１０４－０４＊角倍蚜总ＲＮＡ提取方法的比较及优化武敏，马文丽＊（山西大学生命科学学院，山西太原０３０００６）摘要：采用Ｔｒｉｚｏｌ法及试剂盒柱提法提取角倍蚜若虫及成虫总ＲＮＡ，通过紫外分光光度法（ＯＤ２６０／ＯＤ２８０、ＯＤ２６０／ＯＤ２３０）及琼脂糖凝胶电泳检测，对所提取ＲＮＡ的纯度、浓度及完整性进行了分析．结果表明，采用常规样品量两种方法提取的ＲＮＡ均降解严重，分析认为角倍蚜

2、富含内源性ＲＮａｓｅ．通过大幅降低样品量，优化提取步骤，缩短提取时间，有效消除了ＲＮＡ降解现象．采用Ｔｒｉｚｏｌ法获得了纯度高、完整性好的ＲＮＡ样品，电泳显示清晰的２８Ｓ、１８Ｓ及５Ｓ三条带；试剂盒柱提法获得的ＲＮＡ呈现较为特殊的带型，没有常规的５Ｓ条带，而在７５０ｂｐ～１０００ｂｐ之间有一明显条带．关键词：角倍蚜；ＲＮＡ提取；Ｔｒｉｚｏｌ法；试剂盒柱提法中图分类号：Ｑ９６６文献标识码：Ａ［１］五倍子蚜属同翅目蚜总科瘿棉蚜科，指寄生在漆树科盐肤木属植物上形成五倍子虫瘿的一类蚜虫．角倍蚜（Ｓｃｈｌｅｃｈｔｅｎｄａｌｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）是五倍子蚜中分布最广的一种，

3、其寄生于盐肤木上所形成的角倍产量占五［２－３］倍子总产量的７５％，具有较高的经济价值．［４］提取高质量的ＲＮＡ是基因克隆、ｃＤＮＡ文库构建和基因表达分析等分子生物学研究的最基础工作．［５－６］提取ＲＮＡ的方法很多，常用的有Ｔｒｉｚｏｌ法、异硫氰酸胍法、ＣＴＡＢ法．但由于不同样品化学成分的差异，实际操作中还需依据研究材料的自身特点，对多种方法进行比较优化，找出最适方法，建立最佳体系，才能获得高质量ＲＮＡ．目前虽然已从多种动植物材料中提取到了高质量的ＲＮＡ，但对于蚜虫这一小型昆虫，这方［７－８］面的研究十分有限．本研究采用商品化的Ｔｒｉｚｏｌ法及试剂盒柱提法提取角倍蚜

4、若虫及成虫总ＲＮＡ，经过样品量及提取步骤的优化改进，建立了一个高效、稳定的Ｔｒｉｚｏｌ法提取角倍蚜总ＲＮＡ体系，获得了高质量的角倍蚜若虫及成虫总ＲＮＡ，为进一步的分子生物学研究奠定基础．１材料和方法１．１蚜虫材料角倍蚜由湖北省五峰五倍子基地提供．分别于２０１０年８月底及９月底，采集盐肤木上寄生的角倍，于当天空运至上海．角倍内的蚜虫可存活一周左右，分别为角倍蚜若虫及有翅成虫．实验时用毛笔小心扫取蚜虫于Ｅｐ管内，称量后进行ＲＮＡ提取．１．２试剂及仪器Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自ＴａＫａＲａ公司；ＲＮＡｐｒｅｐｐｕｒｅ动物组织总ＲＮＡ提取试剂盒、ＱｕａｎｔｃＤＮＡ第一链合成试剂

5、盒、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ的Ｅｐ管、Ｔｉｐ头购自天根公司；三氯甲烷、异丙醇、乙醇等其他试剂均为ＲＮＡ实验专用．实验所用的玻璃、金属制品均在１８０℃下烘４ｈ以上．其他仪器设备和试剂均保证干净且无ＲＮＡａｓｅ污染；引物由上海生工生物有限公司合成．１．３ＲＮＡ的提取＊收稿日期：２０１１－０９－２０基金项目：中国博士后科学基金（２０１００４７０６３７）作者简介：武敏（１９８６－），女，山西太原人，硕士研究生，主要研究蚜虫与寄主植物的相互作用．Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｉｎａｓｘ３５＠１６３．ｃｏｍ．＊通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｍａｗｌ＠ｓｘｕ．ｅｄｕ．ｃｎ武敏等：角倍蚜总ＲＮＡ提取方

6、法的比较及优化１０５１．３．１Ｔｒｉｚｏｌ试剂法分别称取角倍蚜若虫及成虫１００ｍｇ，置于液氮预冷的研钵中，在液氮中迅速研磨成粉末；加入１ｍＬ的ＲＮＡｉｓｏＲｅａｇｅｎｔ，室温静置至完全融化，继续研磨至裂解液呈透明状，将匀浆液移至离心管中，室温静置５ｍｉｎ，１２０００ｇ４℃离心５ｍｉｎ，小心吸取上清液，移入新的离心管．用移液枪反复吹吸至裂解液中无明显沉淀，室温静置５ｍｉｎ，加入氯仿０．２ｍＬ，盖紧离心管盖，用力震荡，待充分乳化溶液呈乳白状后，室温静置５ｍｉｎ，１２０００ｇ４℃离心１５ｍｉｎ；此时匀浆液分为三层：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；吸

7、取上清液转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，静置１０ｍｉｎ．１２０００ｇ４℃离心１０ｍｉｎ，小心弃去上清，缓慢沿离心管壁加入７５％的乙醇１ｍＬ（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，１２０００ｇ４℃离心５ｍｉｎ后小心弃去乙醇，室温干燥沉淀２～５ｍｉｎ，加入５０μＬ的ＲＮａｓｅｆｒｅｅ水溶解沉淀，取３μＬ电泳检测，于－８０℃保存．１．３．２柱式ＲＮＡ试剂盒法分别称取角倍蚜若虫及成虫５０ｍｇ，在液氮中迅速研磨成粉末，加入３００μＬ裂解液ＲＬ（主要成分为异硫氰酸胍，含１％的β－巯基乙醇），涡旋剧烈震荡混匀；加入５９０μＬＲＮａｓｅ－ｆｒ

8、ｅｅｄｄＨ