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1、DNA重组技术Geneengineering原理与实践Takeadonoregg,suckoutthenucleus,andhencetheDNA,andfuseitwith,say,askincellfromthehumanbeingcopied.Then,withthehelpofanelectricalcurrent,thereconstitutedcellshouldbegingrowingintoageneticduplicate.重组DNA技术的重大突破引发现代生物技术的兴起，并很快诞生了许多生命科学的高技术产业。重
2、组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术，包括了一系列分子生物学操作步骤。基因工程(geneengineering)就是有意识地将一个生物体中有价值的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产品。重组DNA技术是基因工程的核心DNA重组技术示意图Onebasiccloningtechniquebeginswiththeinsertionofaforeigngeneintoabacterialplasmid.Fig.20.1DNA重组技术质粒、DNA或RNA提取(Extraction)酶切
3、（Enzymedigest)连接（ligation)转化（transformation)筛选（selection)蛋白表达（Proteinexpression)第一节质粒和质粒提取Chapter1PlasmidandPlasmidextract（一）关于质粒 （1）质粒的概念质粒(Plasmid)是双链、闭环DNA分子，以超螺旋状态存在于宿主细胞染色体外的遗传因子。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒的复制和转录依赖于宿主细胞编码的某些酶，离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使无它们也可存活。ChromosomalDNAPl
4、asmid（已经连接外源DNA)单拷贝质粒（plasmid）质粒DNA有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组DNA操作的载体染色体质粒（2）质粒的复制紧密控制型(Stringentcontrol)：只在细胞周期的特定阶段进行复制。染色体不复制时,它也不能复制。松驰控制型(Relaxedcontrol)：在细胞周期中随时可以复制,有多拷贝。蛋白质合成抑制剂-氯霉素使细胞蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受抑制。紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制。（3）质粒的不相容性(Incompatibility)同一复制系统
5、的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中,两种质粒彼此竞争。细胞生长几代后,某个质粒丢失。发酵出发菌株单质粒（4）质粒载体质粒载体是由天然质粒经人工改造而成。与天然质粒相比,质粒载体带有选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和人工合成多克隆位点序列,并去掉了许多非必需序列,使分子量减小,便于基因工程操作。理想克隆载体的特性分子量小、多拷贝、松驰控制型具有多种常用的限制性内切酶的单切点能插入较大的外源DNA片段具有容易操作的检测表型。常用质粒载体大小在1kb至10kb之间，如pBR322、pUC系列、pGEM系列和pBluescript（简
6、称pBS）等。pBR322 old-style generalpurposeplasmid4362bp以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。pUC192.68kbpMultipleCloningSequence(Polylinker)GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACPartofMCSofpUC19andotherplasmidsEcoRIKpnIBamHISalIXbaISmaISacI（二）提取质
7、粒DNA的方法3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。用溶菌酶破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)裂解细胞膜。经溶菌酶和SDS处理后,细菌染色体DNA会缠绕在细胞碎片上,而质粒比细菌染色体DNA小得多，所以3000-5000g离心后，质粒留在上清液中。用强热或酸、碱处理时，细菌线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA)两条链不会分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性蛋白质和细胞碎片缠绕在一
8、起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然超螺旋分子,并溶解于液相中。共价闭环质粒以超螺旋形式存在。提取质粒时，除超螺旋DNA外，还有其它形式质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环
