小RNA测序测序介绍(含miRNA测序原理及案例分析).pdf

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1、小RNA项目介绍Outline1.小RNA测序概述2.小RNA测序标准流程3.后续分析（个性分析）4.案例分享小RNA基础•小RNA是指在生物体中表达的，不编码蛋白，长度较短（18~30nt或40nt）的RNA分子，参与诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。•microRNA，简称miRNA，是目前功能研究较为透彻的一类小RNA(20~25nt)。miRNA通过与特定mRNA的结合调节相应基因的表达，这些基因称为该mRNA的靶基因。miRNA的结构及其形成•miRNA•长度(集中在22n

2、t附近）；•首位碱基多数是U，是G的可能性较小；•2~4位点较少为U。研究背景miRNA的调控作用剪切调控抑制调控多见于植物多见于动物适用范围•模式物种，有参考基因组，miRNA数据库注释较多，找出新miRNA，研究miRNA的功能。•非模式物种，无参考基因组，miRNA数据库注释较少，研究物种中存在的与其他物种同源的miRNA。Outline1.小RNA测序概述2.小RNA测序标准流程3.后续分析（个性分析）4.案例分享小RNA测序技术简介•小RNA测序技术采用胶分离技术，收集样品中18-30nt或18-40nt的RNA

3、片段，利用高通量测序技术，一次性获得单碱基分辨率的数百万条小RNA序列信息，依托强大的生物信息分析平台，鉴定已知小RNA，并预测新的小RNA及其靶标。•小分子RNA是生物体内一类重要的特殊分子，诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。9样品要求样品类型：完整且无污染的总RNA；样品需求量（单次）：≥10μg；样品浓度：≥200ng/μl；样品纯度：OD=1.8~2.2、OD≥2.0、28S:18S≥1.5、260/280260/230RIN≥8.0、23S:16S≥1.5(此项要求

4、只针对原核生物)；提取总RNA时请不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒，也不要使用LiCl沉淀；如果是使用mirVana™miRNAIsolationKit等试剂盒回收的<200nt的SmallRNA（无法判断RNA的完整性），测序请提供浓度≥20ng/µl、总量≥1μg的RNA样品。10SmallRNA测序建库流程SmallRNA:是长度在18-40nt的非编码RNA，在基因表达调控中发挥着重要的作用。小RNA信息分析流程图测序结果过滤及tags统计小RNA注释已知新miRNAmiRNA预测表达量靶基因注释预测富集

5、分析小RNA测序信息分析内容•一.标准信息分析•1.数据产出统计，对原始测序数据去接头，去低质量，去污染•2.18~30ntsmallRNA的长度分布•3.样品间的公共序列和特异序列的分析•4.SmallRNA碱基偏好性分析•5.SmallRNA在选定的参考基因组上的分布（只能选定一个参考基因组）•6.SmallRNA与rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的比对信息•7.SmallRNA与重复序列的比对信息（需提供选定参考基因组对应的重复序列注释信息）•8.SmallRNA与exon/intron的比对信息(需提供

6、选定参考基因组对应的基因注释信息)•9.SmallRNA与miRBase中指定范围的已知的miRNA的比对•10.按照优先级将smallRNA进行分类注释•11.未注释的smallRNA预测，预测新的miRNA，绘制新miRNA的二级结构图•12.已知miRNA的表达量统计•13.已知miRNA的家族分析（需要提供参考物种拉丁文名称）•（注：此处14-19条miRNA包括已知的miRNA和预测出的新的miRNA）•14.样品间miRNA差异分析（2个或2个以上样品）和聚类分析（3个或3个以上样品）•15.MiRNA靶基因预

7、测（需要提供基因编码序列，可选择多做预测算法）•16.MiRNA靶基因GO注释和KEGG通路分析•17.MiRNA的碱基编辑分析（已知miRNA）•18.差异MiRNA靶基因预测•19.差异MiRNA靶基因GO注释和KEGG通路富集分析1.测序结果的过滤全长小RNA总测序tags-低质量tags=tags（有效测序（总测序量）量）1.含有5’接头序列；2.不含3’接头序列；小RNA的测序结果3.插入片段缺失序列；也可以叫reads（如4.长度小于18nt的序列；结题报告帮助文档中），但为了与5.含有polyA的序列；RNA

8、-Seq区别，称6.第1~30个碱基中含有N的序其为tags，因其长列；度较短（18~30/40nt）。7.质量值低于10的碱基数超过4个，低于13的碱基超过6个。2.测序结果统计A•长度分布：图A•同种小RNA的聚类；•样品间公共及特有序列：图BB3.小RNA注释•小RNA的注释基于序列比对。比对参考