高通量测序原理篇-IonTorrent测序原理

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1、高通量测序原理篇-IonTorrent测序原理IonTorrent测序平台的测序仪也是当今非常红火的测序平台，其半导体测序技术同时也是分析肿瘤相关样本的一种非常有效的手段，从今天开始会像大家系列介绍IonTorrent平台的测序技术。1）建库过程建库是在样本DNA片段的两端加上标准的接头这样的一个过程。IonTorrent的建库接头是平头的。这点和Illumina建库接头是3,端带有突出的T碱基粘性末端是不同的。rIZZLZflHINortfurroNeMlArar

2、r在加接头的过程当中，是加入P1接头，并同时加入X接头或者A接头。其中，X或A接头是未来的测序

3、起始端。而P1接头是连到测序珠子的这一端。X接头和A接头的差别是带有Barcode序列的，而A接头是不带有Barcode序列的。Barcode序列用X接头的好处是可以把一个芯片的测序通量分配给儿个文库。测完序之后用Barcode把不同的文库给分开。用A接头的好处是可以直接测到样本，这样对于充分利用测序的读长是更好的，但是它的缺点是没有Barcode,所以一张芯片只能放一个样本。AmpliSeq文库是通过多PCR扩增产物都拿来测序，那在IonTorrent测序当中，AmpliSeq文库是一种非常常见的文库,重PCR扩增出来的DNA,再加上接头做的文库。如果把整个

4、的么测到的两头的20〜30个碱基，都会是PCR引物的序列，而PCR引物是人工设计的，它的序列是已知的。iMultipl«xPCRIonAmpliSeq119PnmerPool如果把这些PCR引物都进行测序，那就会浪费相当大一部分的测序读长和测序数据量。为了解决这个问题，Thermolife公司再设计AmpliSeq的PCR弓幽的时候，在这个引物上特别设计了一种化学修饰。而这种化学修饰可以被PuFa试剂所切断，这样利用PuFa试剂把PCR扩增产物上大部分的引物序列都给切掉在测序的时候就可以尽可能多得测到样本序列。在做好文库之后，接着就要做第二步，就是把文库种到测

5、序珠子上去，并且进行扩增。文库通过油包水PCR,变成可上机的珠子的过程；IonTorrent把文库种到测序珠子上去的方法，是做油包水PCR。也叫emulsionPCR（乳浊液PCR）o油包水PCR包括两个相：油相和水相。其中水相是核心，油相起到分隔作用。水相中包括了：文库、引物、酶、MasterMix、测序珠子这5种PCR反应的主要成分。其中这个测序珠子，是接下来测序的核心载体。这个测序珠子是非常小的，PGM测序仪上用的珠子，它的直径大概平均是24微米。ProtonP1测序芯片上用的珠子，它的直径，大约只有一个微米。这些珠子的表面，共价连接了许多的PCR引物，

6、这个引物的序列正好是和前面文库的P1接头是互补的。每一个油包水PCR都会包含许许多多个这样的，小的测序微珠。水相中的另外一个成分是那个游离的PCR引物，这个游离的PCR引物，它的5,端标记了生物素。这个标记的生物素的作用，我们后面还要提到，这个引物的序列是和前面的A接头或者X接头相一致。准备水相，就是把文库、引物、酶、MasterMix、测序珠子现在水相中混合好，混合好之后加入油，把油和水进行混合，形成乳浊液。在这个乳浊液当中，大部分是油。油把水相分隔成一个一个的小水滴，每个小水滴当中都可能含有o个到若干个文库分子。还会包含9个到若干个的小的测序微珠。与此同时

7、，引物、酶和dNTP是过量的，所以几乎每个小水滴当中都会有足量的引物、酶和dNTP,在整个油包水PCR反应当中，文库分子和测序微珠是限量因素。接着，把混合好的乳浊液进行PCR反应，PCR反应的结果是一个小水滴中，如果它同时有文库分子和测序微珠，那么它就会发生PCR反应，如果缺少文库分子或者测序微珠，就不会发生PCR反应。PCR反应之后，珠子的表面就会长出同一个液滴当中，所含的DNA（文库）分子的扩增拷贝来。这些扩增出来的DNA链是通过共价键连到珠子上的。这个共价连接，可以保证在接下来的测序过程当中，这些连到珠子上的DNA链，不会被（液流）冲走。那么这些DNA链

8、就可以作为稳定的测序模板。油包水PCR完成了之后，要把所有的珠子当中那些发生了PCR反应的珠子给纯化出来。纯化的手段是通过用链霉亲和素的磁珠和刚才经过PCR扩增反应的珠子进行混合。那些发生了PCR反应的珠子它上面的DNA链是连了一个从PCR扩增引物带来的生物素的。生物素会和链霉亲和素很牢固地结合，这样磁珠就会和发生了PCR反应的测序珠子结合在一块。而那些没有发生PCR反应的珠子上面没有连接着生物素，所以，它不会和磁珠结合。接下来用磁铁进行吸附,磁铁吸附磁珠，磁珠会把带了生物素同时带了扩增了的DNA链的那些测序珠子给富集起来。而那些没有和磁珠结合的微珠,是留在上

9、清液当中的,通过清洗就这些洗脱下被洗掉