核酸PAGE电泳方法.doc

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1、玻璃板处理6％的聚丙烯酰胺凝胶属于DNA测序胶，胶厚度仅为0.4mm，从玻璃板上玻璃后难以进行后续的显色操作，因此，必须对玻璃板进行硅烷化处理。在对玻璃板硅烷化处理之前，必须采用温水和洗涤剂将玻璃板彻底洗干净，先以自来水冲去洗涤剂，再用去离子水反复冲洗几遍，晾干或烘干。长玻璃板的处理：A.带PE手套，将洗好的长玻璃板采用95％擦洗2～3次，晾干。用镜头纸蘸取亲和硅烷溶液少许（A4纸大小的玻璃板用150-200μl），涂布在长玻璃板的一侧，整块板涂布均匀，不能有死角。B.4～5min后，用95％的乙醇洗长玻璃板3次，以

2、去除多余的亲和硅烷，待用。短玻璃板（上部带有凹槽）处理：A.更换PE手套，将洗好的短玻璃板采用95％擦洗2～3次，晾干。用镜头纸蘸取剥离硅烷溶液适量（A4纸大小的玻璃板用1-1.5ml），涂布在短玻璃板的一侧，整块板涂布均匀，不能有死角。B.5～10min后，用干净镜头纸擦去多余的剥离硅烷，待用。注意事项：在玻璃板的处理过程中，处理好的玻璃板一侧应该做好标记，保持干净。长短玻璃板分开处理，及时更换PE手套避免交叉污染。最后，玻璃板的硅烷化处理应该在通风橱中进行。凝胶制备在制胶台上固定好玻璃板，保持水平。制备6％的变性

3、聚丙烯酰胺凝胶，一块胶的配方如下：5×TBE16ml尿素（分析纯）33.6g40％的丙烯酰胺12mlddH2O补足至80ml0.25μm滤膜过滤，灌胶前加入10％过硫酸铵（APS）800μl，四甲基乙二胺（TEMED）100μl，充分混匀，水平灌胶。灌胶完成后倒插梳子（鲨鱼齿朝外）封口，水平放置过夜。银染A.电泳完毕，卸板，用超纯水冲洗板外侧后小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在长玻璃板上，避免划破胶面。B.固定：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定溶液（7.5％冰乙酸）浸没,充分振荡至样品中染料完全消失。保留固定溶

4、液，用于终止显影反应。C.洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次5分钟。从水中取出，当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止30s，使水流尽，再进行下一次洗涤。D.染色：凝胶移至0.1％AgNO3（使用前按1.5ml/l加入37%新鲜甲醛）充分摇动30分钟。E.取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10s，迅速转移至显影液。F.显影：在已冷却至4℃的3％碳酸钠溶液中（当天配制，预冷），按1.5ml/l加入37%新鲜甲醛和200μl/l的硫代硫酸钠溶液（10mg/ml）。先倒入一半显影液，第一批条带出现后再加入另一板显影液，轻摇至条

5、带全部出现。G.终止：条带全部出现后，倒入固定液终止显影。H.当不在有气泡逸出，换超纯水洗涤2次，每次3min。I.干胶：将凝胶置于室温干燥。干燥后在可见光灯箱上观察凝胶，数码相机拍照记录。