酶的定向进化考试.ppt

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1、酶的定向进化酶进化的概念体外随机突变的方法基因文库的建立筛选方法定向进化的概念利用基因工程手段对酶的蛋白质分子进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。这一技术领域也被称为蛋白质工程理性设计：一般仅适用于对那些基因结构及表达的蛋白产物的三维结构和功能等方面的信息了解得较为透彻的前提下才采取的方法。非理性设计：不需要了解蛋白质分子的空间结构和机制，而是通过模拟自然进化（随即突变、重组和自然选择），以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法。体外定向进化的意义理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化

2、的基本先决条件。所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。定向进化的原理在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选

3、择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的酶定向进化的基本过程酶基因随机突变构建突变基因文库负突变基因筛选正突变基因进化酶反复进行体外随机突变技术：易错PCR技术DNA重排技术基因家族重排技术定向选择筛选方法：平板筛选法荧光筛选法噬菌体表面展示法细胞表面展示法易错PCR技术定义：在体外扩增基因时使用适当条件，使扩增的基因出现少量的碱基误配，引起突变。通过改变反应体系中镁离子和dNTP的浓度从而引发突变，提高点突变率遗传变化只发生在单一分

4、子内部，属于无性进化易错PCR的不同点镁离子浓度较高稳定非互补的碱基对添加一定浓度的锰离子降低聚合酶对模板的特异性四种底物的浓度配比改变增加错配率DNA改组技术定义：又称有性PCR，它依赖PCR，是基因在分子水平上进行有性重组，通过改变单个基因原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。本质：从两种以上同源正突变基因出发，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程DNA改组技术的基本过程两种以上同源正突变基因DNA随机片段突变基因构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶

5、酶切无引物PCR基因重组反复酶切DNA改组技术的意义2种以上同源基因中的正突变结合在一起，通过DNA碱基序列的重新排布，形成新的基因突变，属于有性进化。本技术将亲本中已有的正突变基因结合在一起，减少负突变，累积正突变，是加速酶分子进化的有效手段重组同时伴随着点突变的产生基因文库的构建构建基因文库的质量要求构建文库的主要过程构建基因文库的质量要求文库的包容性：尽可能的包含基因的任何一种可能的突变信息（正突变、负突变和中性突变）文库的完整性：ＤＮＡ片段必须尽可能完整地反映基因的结构和功能信息。建库的主要过程载体的选择基因重组：在体外，将基因与载体

6、ＤＮＡ连接在一起形成重组ＤＮＡ的技术过程组装突变基因文库：将重组ＤＮＡ转入受体细胞或包装成有感染活性的重组噬菌体的过程切接转增检酶突变基因的定向选择突变基因基因载体突变基因文库筛选目的基因高通量筛选技术平板筛选法荧光筛选法噬菌体筛选法细胞表面展示法核糖体表面展示法平板筛选法依据细胞生长情况筛选突变基因１以提高酶的热稳定性为目标的定向进化２以提高抗生素耐受性的定向进化３以提高酶的ｐＨ稳定性为目标的筛选依据颜色变化筛选突变基因１ＬａｃＺ基因编码半乳糖苷酶和Ｘ－ｇａｌ反应会形成蓝色菌落２在平板中加入硝基酚磷酸（NPP），重组细胞产生磷酸酯酶，会使细

7、胞周围产生黄色，黄色的深浅可以反应酶的活性的高低依据透明圈情况筛选突变基因定向进化的选择策略1、定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。2、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。3、高通量的筛选体系定向进化的应用一．提高酶分子的催化活力二．提高酶分子的稳定性三．提高底物的专一性和增加对新底物．催化活力的进化

8、四．对映体选择性的定向进化五．变换催化反应专一性