高分辨熔解曲线分析技术检测α-地中海贫血常见三种点突变.pdf

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1、中华检验医学杂志2012年5月第35卷第5期ChinJLabMed，May2012，Vo1．35，No．5．短篇论著．高分辨熔解曲线分析技术检测一地中海贫血常见三种点突变魏明廖灿李茹李坚李东至仅一地中海贫血(简称一地贫)是由于仅珠蛋白女44例，年龄4d～50岁，另包括3例产前诊断样基因缺失(缺失型)或点突变(非缺失型)导致仅珠本(羊水、绒毛、脐血各1例)。其中，HbCS突变携蛋白肽链合成减少或完全不合成而引起的一种溶血带者44例，HbQS突变携带者25例，HbWS突变携性贫血，呈常染色体隐性遗传。我国长江以南为高

2、带者12例。各样本基因型及对应例数详见表1。发区，其中广西、广东和海南发病率最高。最新的广所有样本均经跨越断裂点PCR(gap．PCR)、反向点东省大样本分子流行病学调查显示，．地贫携带者杂交和DNA测序鉴定。频率约为8．53％。我国最常见的3种缺失型突表181例o【-地贫点突变携带者基因型资料变为一sE、．o【·和．0【，最常见的3种非缺失型突变为HbConstantSpring(HbCS)、HbQuongSze(HbQS)和HbWestmead(HbWS)。这3种点突变都位于珠蛋白基因第3外显子，由于o【：珠

3、蛋白基因比珠蛋白基因在珠蛋白合成中具有更重要的功能，因此非缺失型一地贫突变所引起的功能缺陷往往比缺失型更为严重J。特别是当合并仪。一地贫(即一靶)时，非缺失型HbH病的临床表现往往重于缺失型HbH病j。因此，在临床实践中，对非缺失型一地贫的明确诊断亦十分重要。2．健康对照者：选取2011年6月至9月广州高分辨熔解曲线(highresolutionmelting，HRM)市妇女儿童医疗中心健康体检者l4名，其中男分析技术不受突变碱基位点与类型的局限，无需序5名，女9名，年龄22～48岁。所有健康对照样本列特异性探针

4、，在PCR结束后直接运行高分辨熔解经测序验证不含(仅和仪：)珠蛋白基因点突变。即可完成对样品的突变筛查和基因型分析。这种方本研究已经过广州市妇女儿童医疗中心医学伦理委法因操作简便、结果准确，并且实现了真正的闭管操员会批准，患者及健康对照者均已签署知情同意书。作而受到普遍关注。本研究将HRM分析技术应用3．标本采集：采集受试者外周静脉血2ml至乙于仅．地贫常见3种点突变的检测，并探讨其临床应二胺四乙酸(EDTA)抗凝管；经腹穿刺抽取羊水用价值。5ml、绒毛约5mg，脐血1ml收集至EDTA抗凝管。一、对象与方法4．

5、仪器与试剂：缺失型和非缺失型仅．地中海贫1．仅一地贫点突变携带者：收集2008年12月至血基因诊断试剂盒由深圳益生堂公司生产，PCR聚2011年10月广州市妇女儿童医疗中心基因型已知合酶由美国Promega公司生产，LCGreenPLUS由美的仅一地贫点突变携带者样本81例，其中男34例，国IdahoTechnology公司生产；PCR仪由美国BIOMETRA公司生产，LightScanner96由美国IdahoDOI：10．3760／ema．J．issn．1009。9158．2012．05．016Techino

6、logy生产。基金项目：广州市科技计划项目(2009Z1．E131)；国家自然科学5．基因组DNA提取：采用日本Fujifilm公司全基金资助项目(81100435)基因组核酸提取试剂盒提取所有样本DNA，用作者单位：510623广州医学院附属广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心NanoDrop1000紫外分光光度计测定核酸浓度及纯通信作者：廖灿，电子信箱：canliao@126．corn度，将DNA浓度标准化为lO～20ng／l，吸光度()中华检验医学杂志2012年5月第35卷第5期ChinJed，May2012

7、，Vo1．35，No．5因点突变，其方法是首先选择性地扩增o／．和OL珠正常，因此在地贫筛查时很容易漏诊(除外Hbcs)。蛋白基因，然后在扩增产物的基础上二次扩增3个本研究所建立HRM分析方法，可从分子水平有效外显子，最后进行熔解曲线分析。与本研究所建立准确地检测中国人群常见的3种仅．地贫点突变，可的方法相比较，其方法需进行两轮PCR，操作复杂为大规模突变筛查提供有效的技术支持。在产前筛耗时；其次，其方法无法检测仅．地贫点突变合并缺查时，特别适用于夫妇一方为O／．0-地贫时，对另一方失型突变，易造成非缺失型HbH

8、病漏诊。因为对进行点突变检测。于携带0【．地贫点突变合并缺失型突变的样本，Shih参考文献所建立方法仅能扩增一条染色体上的或仪珠蛋白基因，而另一条同源染色体上的珠蛋白基因由[1]XuXM，ZhouYQ，LuoGX，eta1．TheprevalenceandspectrumofalphaandbetathalassaemiainGuangdongProvince：于缺失无法