双液相系统中分枝杆菌降解植物甾醇为雄烯二酮的工艺优化.pdf

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1、双液相系统中分枝杆菌降解植物甾醇为雄烯二酮的工艺优化柏挺上海新华联制药有限公司上海I摘要l雄烯二酮(AD)是制备甾体激素类药物不可替代的中间体。本1．3．4转化率计算方法文在基于15Ld、试发酵规模上，优化大豆油／水双液相系统中分枝杆茵降发酵完成后，取2ml发酵液以体积比l：功口入乙酸乙酯萃取，取上清解植物甾醇为雄烯二酮(AD)的工艺。研究了大豆油在发酵液中的最佳比例，液稀释100倍，进高效液相色谱仪。色谱条件：Symetry@C18柱，流动植物甾醇的投料量以及添加表面活性剂对提高植物甾醇转化率的影响，得相甲醇：水=65：35，

2、流速1．0ml／min，柱温3O℃，检测波长240nm，进到最佳转化工艺条件：大豆油20％，投料量1．5％，添加0．2％吐温-80，转化样量20L。96h，植物甾醇最终转化率为87．5％。转化率计算：【关键词】双相系统；分枝杆菌；雄烯二酮；植物甾醇；表面活性剂靴率=丽舢％雄甾-4-烯一3，l7-二酮(andr0s卜4一ene一3，17-dione，简称AD)，是制造甾体激素类药物合成的关键中间物质之一，几乎所有的甾体激素0．97一甾醇纯度0．66一AD与甾醇摩尔质量比药物都是以AD作为起始原料进行生产的n】。目前国内主要从野生中

3、药二，结果与分析材“穿地龙”等植物中提取薯蓣皂苷元后经化学合成而成，工艺十分复2．1不同比例的大豆油对甾醇转化率的影响杂，成本很高，而且污染环境大豆油对甾醇及AD均有较好的溶解性，在增加底物浓度的同时微生物降解甾醇的工作开始于20世纪60年代，已发现多种微生物对细胞的毒性又较小，而单纯的提高大豆油比例也会破坏油／水双相可将植物甾醇侧链选择性的切除得~I]AD。微生物法生产AD主要受甾平衡，影响细胞的生长代谢，同时也会造成生产上的浪费生产成本的增醇在水中溶解度低的限制，甾醇在水中的溶解度低于2mg／L，产物AD加。根据文献及相关试

4、验摸索，如表1所示，大豆油含量20％左右，甾醇在水中的溶解度也不高zJZ50mg／L“，甾体化合物的难溶性是限制微生转化率较高。物转化工业化最主要的障碍之一。传统的单水相发酵多采用添加少量I表1大豆油／Tk双相系统下甾醇转化率l有机溶剂、表面活性剂的方法来提高甾醇在发酵液中的溶解度，效果并不理想，而且有机溶剂等对细胞产生毒性以及对安全、环保等因素影lAD转化率％122．8J70．5182．1174．9168．4l响，从而制约了其在工业化上的应用。采用大豆油／Tk双液相发酵系统，2．2不同投料量对甾醇转化率的影响可以有效增加甾醇的

5、溶解度，提高底物投料量，而且减少了对细胞的毒甾醇是一种疏水性化合物，难溶于水，过量底物难以被大豆油溶解性。本文主要研究了大豆油在发酵液中所占比例，植物甾醇的投料量以分散，且会对细胞产生毒性，不利于转化率的提高，从而对原料造成浪及添加表面活性剂对植物甾醇转化率的影响。费。在大豆油／水双相发酵系统中，随着甾醇投料量的增加，转化率上升一．材料与方法到一定水平后呈下降趋势。当投料浓度达到1．5％时转化率可达到85％左1．1材料右，继续提高甾醇投量至2％转化率下降至80％以下。1．1．1菌种2．3不同比例吐温一80对甾醇转化率的影响分枝杆

6、菌MycobacteriumspHL一501(上海新华联制药有限公表面活性剂的分子结构与细胞膜相似，在微生物转化过程中，它可司菌种室保藏)。以增加底物的溶解度，同时改变细胞膜的通透性。吐温80是一种常见的1．1．2试剂水包油型表面活性剂，试验证明在大豆油／水双相发酵培养基中添加吐甾醇为进口甾醇，大豆油购于上海良友海狮油脂实业有限公司，吐温80可有效提高甾醇转化率，投量为0．2％时，转化率可达N85％左右。温8O购于上海申宇医药化工有限公司，其他试剂均为国产分析纯。低于该浓度，其对甾醇的溶解能力及对细胞膜通透性影响较小，而高于1．

7、1．3培养基该浓度，则破坏细胞膜通透性，转化率均不能达到理想水平。斜面培养基(g／L)：牛肉膏5；胰蛋白胨l0；葡萄糖25；琼J]~20，灭2．4正交试验菌后pH6．8-7．2。根据单因素试验结果，选择大豆油投料浓度，底物甾醇投料浓度种子培养基(g／L)：葡萄糖8；玉米浆65，酵母膏4；NaN05，和吐温80投料浓度3因素，以AD转化率为考察指标，设计L。(3)正交(NH4)2HPO40．5，灭菌后pH6．8-7．2。试验，正交试验设计及极差分析见表2，方差分析见表3。转化培养基(g／L)：大豆油200；甾醇15；玉米浆65；酵

8、母膏4；表2正交试验设计及极差分析NaNO35}(NH4)2HPO40．5，吐温80l_5，灭菌后pH6．8—7．2。试验号A(大豆油B(甾醇浓C(吐温80空列转化率％1．2仪器设备浓度)％度)％浓度)％美国安捷伦1260高效液相色谱仪；上海国强生物工程有限公司