拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备.pdf

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1、第42卷第4期上海师范大学学报(自然科学版)VoJ．42，No．42013年8月JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences)Aug，2013拟南芥AtERFI蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备张钰，李亚会，屠唯一，陈晨，高菊芳(上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234)摘要：转录因子AtERF1属于ERF／AP2家族的B3亚家族，参与植物的防卫反应．根据密码子简并原理，用基因全合成的方法合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码拟南芥AtERF1蛋白的碱基序列，并将其克隆到原核表达栽体pET一29b．将表达载体AtERF1一p

2、ET一29b转入大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG成功诱导表达了分子量约30kD的AtERF1蛋白，该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在．以该蛋白为抗原免疫家兔，制备出的多克隆抗体经免疫双扩散测定效价达1：16，Westernblot检测表明该抗血清与AtERFI蛋白识别良好．AtERF1抗体的制备为进一步从生化水平上研究AtERF1的功能奠定了良好基础．关键词：原核表达；拟南芥；AtERF1蛋白；密码子优化；多克隆抗体中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：1000-5137(2013)04-0378-06O引言ERF(ethyleneresponsivefactor)是植物所特

3、有的一类转录因子．ERF家族成员在结构上有共同的特点：每个成员都含有一个大约由60个氨基酸组成的非常保守的DNA结合域，含有ERF结合域的转录因子在植物中广泛存在，并且参与植物的生长发育及生理生化反应的信号转导¨．植物防卫信号传递途径方面的研究表明：针对不同的病原物的诱导防卫反应相应地受到不同的信号传递途径的调控．水杨酸(salicylicacid，SA)、乙烯(ethylene，ET)和茉莉酸(jasmonicacid，JA)在防卫信号传递途径中起着重要的作用j．大量证据表明：依赖于sA、ET或JA的信号传递途径之间存在着一定的交叉作用(cross—talk)．绝大部分情况下，依赖于

4、ET的信号传递途径与依赖于．1A的信号传递途径间存在着协同促进的作用．外源ET和JA都能够迅速诱导AtERF1表达，两者之间存在协同促进作用．而且，AtERF1的超表达能够恢复ein2和einl突变体的防卫反应能力．通过AtERF1转基因拟南芥的转录组分析和野牛拟南芥在ET和JA处理下的转录组分析，说明AtERF1在体内能够调控那些应答ET和JA的基因的表达．总的试验结果表明：AtERF1是ET和JA信号途径中的下游成分，而且在2个防卫反应基因调控信号途径交织点处起着重要的作用．AtERF1基因的超表达，增强了拟南芥对灰霉(Botryt~cinerea)、核盘菌(Sclerotinia

5、sclerotiorum)、Erysipheorontii的抗性J．但是AtERF1蛋白究竟调控哪些目的基因行使功能，目前尚不十分清楚．原核表达系统的优点在于能够在较短时问内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉．住收稿日期：2013-05—17基金项目：国家自然科学基金项目(30970268)；上海师范大学大学生创新项项目(B一9001—12—003143)作者简介：张钰(1990一)，女，上海师范大学生命与环境科学学院本科生；高菊芳(1962一)，女，博士，f海师范大学生命与环境科学学院副教授．通信作者第4期张钰，李亚会，屠唯一，等：拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多

6、克隆抗体的制备本研究中，利用密码子优化法人工合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码AtERF1蛋白的DNA序列，并以此为基础构建了原核表达载体AtERF1一pET29b，将其转人大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后在原核细胞中成功表达了AtERF1蛋白，该蛋白以可溶蛋白的形式存在．利用SDS—PAGE法纯化了AtERF1蛋白，并作为抗原免疫家兔，制备出了效价高，特异性强的多克隆抗体，这些工作为进一步用生化手段研究该转录因子的DNA结合位点和下游基因奠定了基础．1材料与方法1．1试剂和材料1．1．1质粒与菌株原核表达载体pET一29b(Novagen产品)由陶黎明教授赠送，大肠杆菌感

7、受态菌株DH5ot及BL21(DE3)由上海师范大学植物功能基因实验室提供．1．1．2生物学试剂T4DNA连接酶、限制性内切酶NdeI、XhoI和DreamTagDNA聚合酶购自Fermenant公司；硝酸纤维素膜、dNTPs、PCR产物回收试剂盒、Tris、SDS、TEMED及IPTG等常用分子生物学试剂购自北京鼎国生物技术有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、ECL化学发光检测试剂盒、PVDF膜购自艾比玛特生物医药(上海)有