如何控制禽流感血凝抑制试验的质量.pdf

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1、试验研究禽流感血凝抑制试验是对禽类进行禽流感疫苗抗体水来源于不同个体鸡平的监测，广泛使用的试验方法。该试验方法的优点是经济、只的红细胞对禽流感病快速、可靠、操作简便，能够处理大量的样品，并在短时间内毒的敏感性不同，一般血报告禽类血样的禽流感抗体滴度水平。但是该试验的结果受凝试验的滴度相差12操作技术影响很大，实验过程中的质量控制十分关键。个滴度。并且有的鸡红细1样品的采集和处理胞有自凝现象，所以试验1．1样品的采集气温在23℃以上时，采集完的活禽血样时最好采用3羽以上成在2h内就可以析出清亮的血清。在气温10％左右的时候，采年SPF公鸡或无禽流感集完的活禽血样血清很难自然析出，最好立

2、即将采集针筒放和新城疫等抗体的健康马入37％培养箱中孵育2h，可见血清析出。公鸡的血配置好的红细晓1．2待检血清的处理一般情况下，5d内测定的血清样品胞，1％红细胞悬液制备霞可放置于4~C冰箱内冷藏，样品待见超过一周的，需放人冰柜中最后一次洗涤2000转冰冻保存。／min离心10min，进行红1．3冻结血清的处理冻结血清融化后，会出现蛋白质局部细胞压积。浓缩，分布不均的现象。在检测前应充分混匀。检测样品还应避54个血凝单位抗原的免多次冻融周期，以防样品抗体受损害，建议不超过3-5个冻融配置周期。对于确实需要多次分批检测的，可将血清样品分装。先对抗原作血凝试1．4非特异性凝集素的处理在

3、该试验中，鸡血清极少出现验，抗原与红细胞完全凝非特异性阳性反应，没有必要在试验前对血清进行预处理。集的孔作为抗原效价。再除鸡以外有些禽(如水禽)的血清可能对鸡红细胞产生非特根据抗原效价，配成4个异性的凝集。这种特性的确定可用待检血清做血凝试验，如血凝单位抗原，4个血凝单位抗原需现配现用。为保证4个血果待检血清也出现凝集红细胞的现象，则说明有非特异凝集凝单位抗原的配置准确无误，需作抗原回归试验。取25L的素的存在，需用鸡红细胞对待检血清进行吸附，以去除非特PBS加入反应板的第2~6孔；并将调制的4个血凝单位抗原异凝集素。方法是：每0．5mL的抗血清中加入0．O25mL的鸡50L加人第一

4、孑L，然后依次倍比稀释至第6孔，最后弃去红细胞，轻摇后静止30min，800转／min离心2-5min，收集上25L；个孔再加入PBS25IxL，最后加入1％红细胞悬液0o=0．∞∞／J．Is∽N．_I．I●0_20．I∞．0．0清液，即为处理后的血清。也可用被检禽种的红细胞。25L混匀，室温静止40min观察结果。若第1、2、3孔出现完2器材的选择和使用全凝集，第4孔出现75％的凝集，表明该4个血凝单位抗原配一辽宁省喀左县动物疫病预防控制中心，喀左12∞00—为了使器材保待最佳工作状态应建立选择、使用、维护器材置准确，可用于HI试验。如果第4孔也出现完全凝集，说明该的标准操作程序，

5、所用器材主要有单、多道可调微量加样器、微血凝价提高了一个滴度，需等量稀释抗原；如果只有前2孔出量反应板、吸头等，微量反应板、吸头尽量使用一次『生产品。现完全凝集，说明该血凝价降低了一个滴度，抗原需加倍。2．1单、多道可调微量加样器在使用前或使用一段时间后6加样均应进行校正血或鉴定凝。使用抑时需注制意：(1)吸试取液体验时一定的要质量在HI试验中有4次加样步骤，即加PBS、待检血清、4个平稳地松开拇指，决不允许突然松开，以防止溶液吸入过快，血凝单位抗原、l％红细胞悬液。加样时需注意：(1)使用微量冲入加样器内腐蚀柱如塞而造何成漏气控；(2)为制了获得禽较高的流精感加样器吸取液体时，吸头

6、需碰触管壁以除去多余的液体。(2)确度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为加样时应将所加物加在v型板底部，避免加在孑L壁上部，并吸取血清时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小注意不可溅出。(3)注意吸头勿碰触到v型板孔，以免发生交而产生误差；(3)取样时只需按到第一档停点，排样时需按到叉污染。(4)倍比稀释时，要避免产生过多的泡沫，使混合不第二档停点才能彻底排除，已达到准确的取样量。均，影响检测结果准确性。(5)1％红细胞悬液在试验过程中须2．296孔v型微量反应板建议使用96孑L90度V型一次随时用随时摇匀，使之呈均质状态。性优质塑料反应板，进行HA—HI试验

7、，可避免使用有机反应7孵育板清洗不净和过度磨损而影响试验结果。孵育温度对试验的影响很大，温度过低，反应速度减慢；2．3吸头吸头经超声波清洗、高压灭菌后反复使用，使温度过高会使反应结果洗脱加快，所以孵育温度常控制在室用一段时间后要淘汰，及时更新。温(20～25℃)。此外，孵育时间也须严格控制，一般来说，以红3缓冲液的配置血球对照完全沉淀的前后5rain内判定试验结较好，大约在试验使用稀释液必须为0．Olmol／L，pH7．0—7．2的等渗磷30—40min左