血凝抑制试验

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1、血凝抑制（HI）试验简介（以禽流感病毒为例）一、原理流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。二、应用该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。三、缺点只有当抗原和抗体HA亚型相一致时才能出现HI现象，各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血

2、清中的非特异凝集素；需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。四、试验步骤1阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g8，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。（3.8%枸橼酸钠（3.8g枸橼酸钠，100ml超纯水），101kPa,20min高压灭菌，4℃保存备用,保存期1个月）。210%和1%鸡红细胞液的制备2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL（3.8%枸橼酸钠），取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡

3、，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合（3.8%枸橼酸钠），放入装10mL阿氏液（生理盐水）的离心管中混匀。2.2洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800r/min离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液（生理盐水），轻轻混合，再经1500～1800r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20mL（生理盐水），轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。2.310%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离

4、心管中离心1500～1800r/min8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。8（此步可省略，直接配制1%红细胞）2.41%鸡红细胞液取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1mL，加入9mL生理盐水，混合均匀即可。（根据检测血清的数量，估算一下需要的1%鸡红细胞量，可按0.3ml/每份血清）3抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）3.1在微量反应板的1孔～12孔均加入25µlPBS（生理盐水），换滴头。3.2吸取25µl抗原加入第l孔，混匀。3.3

5、从第1孔吸取25µl，病毒液加入第2孔，混匀后吸取25µl加入第3孔，如此进行倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25µl弃之，换滴头。3.4每孔再加入25µlPBS（生理盐水）。3.5每孔均加入25µl体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。3.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。3.7结果判定将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表）。8表1：血凝试验结果判读标准类别孔底所见结果12345红细胞全部凝集

6、，均匀铺于孔底，即100%红细胞凝集红细胞凝集基本同上，但孔底有大圈红细胞于孔底形成中等大的圈，四周有小凝块红细胞于孔底形成小圆点，四周有少许凝集块红细胞于孔底呈小圆点，边缘光滑整齐，即红细胞完全不凝集++++++++++-能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效。4血凝抑制（HI）试验（微量法）4.1根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU

7、的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。4.2在微量反应板的1孔～11孔加入25µlPBS（生理盐水），第12孔加入50µlPBS（生理盐水）。4.3吸取25µl血清加入第1孔内，充分混匀后吸25µl于第2孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25µl弃去。4.41孔～11孔均加入含4HAU抗原25µl，室温（约20℃）静置至少30min。4.5每孔加入25µl1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃8条件下进

8、行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。4.6结果判定试验成立的条件：只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。HI价小于或等于31og2判定HI试