血凝试验和血凝抑制试验用于禽流感抗体检测.pdf

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1、中国畜牧兽医文摘2014年30卷第8期基础科学血凝试验和血凝抑制试验用于禽流感抗体检测常耀祖杨永春施进文(宁夏同心县动物疾病预防控制中心，宁夏吴忠751300)近年来，高致病性禽流感疫情在世界各地均有发生，人感染④全部试验均采用同一种稀释液。高致病性禽流感的事件越来越多。预防高致病性禽流感已成为全(3)1％红细胞制备的注意事项球性的大事。防制高致病性禽流感的主要措施是对禽鸟进行禽流①为避免鸡只红细胞发生自凝现象，在配制1％红细胞悬液感疫苗的预防接种，同时，提倡有效免疫，要求免疫的禽只体内时，最好选择采取2—3只SPF鸡，或未进行过任何免疫的成年公产生足够高的抗体，以抵御

2、禽流感病毒的侵袭。为此，我国各地鸡血液。采血的前提条件是要按1／10采血量的比例在一次性注射的动物防疫监督机构需要对禽鸟进行定期的禽流感疫苗抗体水平器中加人抗凝剂，如，肝素、枸椽酸钠、柠檬酸钠等。的监测。②采血完毕后，分装至2ml容量的圆底离心管中，因为通过2对禽流感抗体水平的监测一般采用血凝试验和血凝抑制试验ml与1．5ml两种容量离心管相比较，放入1．5ml尖底离心管时，(HA—HI试验)，其技术规范依照GBf18936—20o3进行。该试验方离心后，离心管底部红细胞不易与加入的PBS液混匀，易沉积在管法具有经济、操作简便和对抗体水平进行量化的优点，已在各地底部，达

3、不到洗脱干净的目的。动物防疫监督机构和养殖场广泛使用。③经2000—3000r／min，510min，弃去上液和红细胞1样品的保存上层的白细胞薄膜，再加入1O倍以上血量的PBS液，上下缓匣颠倒(1)采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管(切忌用力过大使红细胞破裂)，使其充分混匀，再离心弃去上中，标记清楚，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运清液，反复几次，直至上清液清亮透明为止。输过程中剧烈震动。④在加红细胞过程中，还须不断轻摇，以确保红细胞均匀，(2)一般情况下，在5d内检测的样品可放置在4℃的冰箱使其每孑L加入相同数量的红细胞。中冷藏，否则，低温冷冻保

4、存。⑤制备好的红细胞液如果放置后上清液变红，说明有溶血，(3)在检测前血清样品应充分混匀，混匀时采用上下缓慢颠不可再使用。倒几次的方法即可，切忌剧烈振荡，引起产生气泡及血清中蛋白5抗原液的配制变性。①先做血凝试验测定效价，以抗原与红细胞完全凝集的孔为(4)对出现胶胨状的血清样品，可采用反复搅动几下，再离1HUA抗原，配制4HUA抗原应往前推算2孔，即除以4后的值。心的方法有助于缓解该状态。胶状物是含纤维蛋白和纤维蛋白原②每次做试验前，必须重新检测禽流感抗原的血凝效价，以的血清，可能是由于放置时间不够，造成血清未完全析出。不建免效价发生改变而导致抗原稀释倍数不准确，从而导

5、致试验结果议直接吸取其中少量的清亮血清。不准确。2材料准备③为保证配制的抗原准确，还要进行抗原回滴试验。具体方检测使用96~L90。v型微量反应板，要确保每个孔清洁，每法：做2排抗原回滴，在2排的第1～8孔各加25lPBS，取4HAU次使用后要立即用清水冲洗孔中的反应物，通过反复试验证明：抗原25l加在第2排的第1孔、第2孔，混匀，从第2孔倍比稀90ov型板相对于110。板及130。板来讲，具有红细胞沉降速度释至第4孔，弃去25l另一排同样。从第2至第8孔补25l快，产生的凝集图像清晰、结果容易判定等优点。PBS，以保持75l总量不变，另一排同样。2排的第1～8孔各加3

6、移液枪的使用25ll％红细胞，震荡10s。静置30min观察结果。这样在第l(1)单道、多道可调微量移液枪，应选择合适的量程，以便孔为4HAU抗原，第2孑L为2HAU~原，第3孔为1HAU抗原，第4孑L为精确度的提高。I~HAU抗原，均为75l总量，第5—8孑L为空白对照。如果抗原回(2)使用时，应采用一档吸液、二档排液的方法。吸取液滴试验不成立，应相应调整抗原浓度直至回滴试验成立。原因：体时，枪头要深入液下，缓慢平稳吸液。加缓冲液时，应加在板如果抗原浓度过高，则所测定的抗体效价水平偏低，如果抗原浓孔底部。倍比稀释血清时，应每孔至少反复吹吸6次，以便混合均度过低，则所测

7、定的效价偏高。所以不调整抗原浓度至实验成立匀。注意：尽量避免产生泡沫引起混合不均。加抗原及红细胞时的话会对结果有很大影响。应在板内液面上方加样，以免交叉污染，影响试验结果。6结果判定(3)加样、倍比稀释时，应高度集中注意力，以免漏加、重每次试验必须设阳性及阴性(空白)对照血清，判别试验是复加样等。否成立。判读结果时，将酶标板倾斜45。，以孔底沉淀的红细胞4试剂的保存及配制流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒为凝集完全抑制。(1)禽流感血凝抑制试验所用的抗原、阳性血清应严格按照试验器具的清洗每次试验完毕后，应将酶标板中液体甩净，说明书的要