生化实验三--果蔬中蛋白质含量测定.ppt

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1、生物化学实验第一部分果蔬成分的生化分析综合实验一：果蔬成分的生化分析实验一果蔬中维生素C的定量测定（4学时）实验二果蔬中总糖及还原糖含量的测定（4学时）实验三果蔬中蛋白质含量的测定（4学时）实验四果蔬中过氧化物酶分析（12学时）实验材料：冬枣＋柚子——1～4组梨（2个品种）——5～8组盘菜＋萝卜——9～12组实验三果蔬中蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）一、目的1、掌握蛋白质测定的方法和技术。2、了解果蔬中蛋白质的含量。二、原理考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝

2、色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。三、实验器材1、可见光分光光度计2、旋涡混合器3、试管16支四、实验试剂1、标准蛋白质溶液——牛血清清蛋白(bsa)：配制成1.0mg/mL和0.1mg/mL的标准蛋白质溶液。2、考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50mL95%的乙醇后，再加入120mL85%的磷酸，用水稀释至1L。3、0.05mol/LTri

3、s-HCl缓冲液（pH6.8）4、各种果蔬五、操作1、标准曲线绘制：取6支试管，按下表加入各试剂。管号试剂012345100g/mL牛血清白蛋白溶液／mL00.20.40.60.81.0蒸馏水／mL1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝液／mL5.05.05.05.05.05.0加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。以各管相应标准蛋白质含量（g）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品制备：称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mL

4、H2O或0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2mL水或缓冲液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm离心15～20min，其上清液即为蛋白质提取液，供分析用。（注：盘菜，萝卜稀释至10mL）3、样品测定：试管中加自制蛋白质样品1.0mL，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。注意事项：⑴、如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光

5、吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。⑵、测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，测定完后可用95%的乙醇将蓝色的比色杯洗干净。实验三果蔬中蛋白质含量的测定（Folin-酚试剂法）一、目的1、掌握蛋白质测定的方法和技术。2、了解果蔬中蛋白质的含量。二、原理Folin-酚试剂法是双缩脲法的发展。其试剂由甲、乙两部分组成。甲试剂相当于双缩脲试剂，可与肽键起呈色反应。乙试剂（即Folin-酚试

6、剂）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色（钼蓝和钨兰的混合物），其颜色深浅与蛋白质的含量成正比，因此通过比色可测定蛋白质的浓度。本方法最大的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍，较紫外分光光度法灵敏10～20倍。三、实验器材1、分光光度计2、电热恒温水浴箱3、试管15×150mm4、刻度吸管0.5mL、1mL、5mL5、试管架6、容量瓶500mL7、坐标纸四、实验试剂1、甲试剂：①：2g无水碳酸钠，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液100mL混匀；②：称取CuSO4·5H2O0.5g，加入1%（35mmol

7、/L）酒石酸钾钠溶液100mL，混匀。使用前将①与②按50:1混合即成碱性硫酸铜溶液。（混合后，试剂只能使用一天，但碱性溶液和0.5%CuSO4·5H2O溶液可分别长期保存）2、乙试剂：在2L磨口回流装置中加入100g钨酸钠，25g钼酸钠及700mL蒸馏水，再加入50mL85%磷酸及100mL浓HCl，充分混合后用小火回流10小时。回流完毕冷却后，加入150g锂，50mL蒸馏水及液体溴数滴，摇匀后再开口沸腾15分钟，以驱逐过量溴。溶液冷却后稀释至1000mL，溶液呈透明淡黄色，置于棕色瓶中暗处冰箱内可长期保存。使用前用

8、标准NaOH溶液标定，以酚酞为指示剂，标定其酸度为1mol/L，此为乙试剂应用液，置冰箱中可长期保存。3、牛血清白蛋白标准液（200g/mL）：准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/LNaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到250mL。4、0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8）5、各种果蔬五、操作1、标准