苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达.doc

《苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达　　摘要：从苏云金芽孢杆菌Ｔ０４Ａ００１中提取基因组ＤＮＡ，通过ＰＣＲ的方法克隆了几丁质酶ｃｈｉＡＣ基因。置换ｃｈｉＡＣ基因的启动子为Ｔ７启动子时，ｃｈｉＡＣ基因能在ＩＰＴＧ诱导下在大肠杆菌中大量表达，并产生大小约７０ｋＤａ的表达产物。　　关键词：苏云金芽孢杆菌；几丁质酶基因；克隆；序列分析；表达　　中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11403－0599-04　　　　ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣｈｉｔｉｎａｓｅＥｎｃｏｄｉｎｇＧｅｎｅｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　　Ｔ０４Ａ００

2、１Ｓｔｒａｉｎ　　　　ＣＡＩＹａ－ｊｕｎ1，2，ＹＵＡＮＺｈｉ－ｍｉｎｇ2，ＨＵＸｉａｏ－ｍｉｎ2，ＣＡＩＱｕａｎ－ｘｉｎ2　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＣｈｉｔｉｎａｓｅｇｅｎｅｃｈｉＡＣｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙＰＣＲｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＴ０４Ａ００１ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｈｉＡＣｕｎｄｅｒＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧ；ａｎｄｉｔｐｒｏｄｕｃｅｄａｐｒｏｔｅｉｎｗｈｏｓｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｗａｓａｂｏｕｔ７０ｋＤａ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌ

3、ｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ；ｃｈｉｔｉｎａｓｅｇｅｎｅ；ｃｌｏｎe；ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　　　　几丁质酶在芽孢杆菌中广泛存在，目前已有多种芽孢杆菌的几丁质酶基因得到了克隆与表达，如环状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌等［１，２］。苏云金芽孢杆菌因为对多种害虫具有毒杀作用而一直为人们所关注，目前已有十多个亚种的苏云金芽孢杆菌被证明能产生几丁质酶［３］。有报道证明，苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶对其杀虫毒力具有增效作用，其杀虫毒力与几丁质酶的活力呈高的正相关［４］，表明几丁质酶在外界因素对害虫的侵害中起

4、着重要的作用。增加外源的几丁质酶可以提高苏云金芽孢杆菌杀虫效果，而用阿洛菌素抑制苏云金芽孢杆菌的几丁质酶后，ＬＣ５０值增高［５］。因此，对苏云金芽孢杆菌几丁质酶的性质、编码基因的序列差异性以及几丁质酶基因的表达等方面进行研究，可为几丁质酶更好的应用于生物防治提供依据。　　本研究对产几丁质酶活力高的Bt菌株Ｔ０４Ａ００１［６］的几丁质酶基因进行了克隆、测序分析，并将Ｔ０４Ａ００１菌株的几丁质酶基因ｃｈｉＡＣ的开放阅读框在Ｔ７启动子调控下进行原核表达。几丁质酶基因的序列测定及其在大肠杆菌中的大量表达为研究芽孢杆菌几丁质酶的进化关系、几丁质酶的纯化与制备及更进一步研究提供了条件。　

5、　１材料与方法　　１．１菌株与培养基　　Bt菌株Ｔ０４Ａ００１为本实验室分离保藏，大肠杆菌ＤＨ５α、ＢＬ２１为本实验室保存菌株。ＬＢ培养基；氨苄青霉素和卡那霉素使用终浓度分别为５０μｇ／ｍＬ和３０μｇ／ｍＬ，ＩＰＴＧ使用终浓度为　　１ｍｍｏｌ／Ｌ。　　１．２主要试剂与仪器　　所用内切酶均购自ＴａＫａＲａ公司；质粒提取、ＰＣＲ产物回收和ＤＮＡ片段快速纯化试剂盒购自ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ公司；Ｈｉｓ－bｉｎｄ亲和层析蛋白纯化试剂盒购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司；其余常规试剂均为Ｓｉｇｍａ进口分装。主要仪器有美国ＢｉｏｔｅｃｓｙｎｅｒｇｙＨＴ全波长自动酶标仪，美国ＡＢＩ９８００

6、ＰＣＲ仪，电泳系统为美国ＢｉｏＲａｄＤＮＡ电泳系统和蛋白质电泳系统。　　１．３ＤＮＡ的提取　　大肠杆菌质粒ＤＮＡ提取参照《分子克隆实验指南》第二版小量碱法进行［７］。　　芽孢杆菌的总ＤＮＡ按照如下方法提取。将芽孢杆菌单菌落接入ＬＢ培养基中，３０℃２００ｒ／ｍｉｎ振荡培养４～５ｈ至ＯＤ６００约０．６～０．８，取１．５ｍＬ菌液至Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，离心收集菌体，用ＴＥＳ缓冲液洗涤菌体１次，沉淀中加入５００μＬ含１０ｍｇ／ｍＬ溶菌酶的ＴＥＳ，混匀后３７℃下作用１．０～１．５ｈ至菌体形成原生质球，加１００μＬ１０％ＳＤＳ溶液及终浓度为２ｍｇ／ｍＬ的蛋白酶Ｋ，上下颠倒数次混匀，３７

7、℃下作用１ｈ，１２０００r／min离心１０ｍｉｎ，上清加等体积的酚氯仿抽提后，加入两倍体积预冷无水乙醇温和混匀，－２０℃放置３０ｍｉｎ左右后１２０００r／min离心１０ｍｉｎ，沉淀用７０％乙醇洗涤，风干，最后溶于含２ｍｇ／ｍＬＲＮＡ酶的适量的无菌去离子水中。　　１．４几丁质酶基因的ＰＣＲ扩增　　根据ＧｅｎＢａｎｋ中Ｂｔ以色列亚种几丁质酶基因全序列设计了扩增引物［８］，ＩＣＨＩ１５′－ＧＴＣＧＡＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＡＴＡＣＣＡ－３′，ＣＣＨＩ１５′－ＧＧＧＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴＣ－３′