猪常见病PCR检测程序.doc

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1、猪病检测手册17目录猪瘟RT-PCR检测程序3猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序5高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序7猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序9猪伪狂犬病毒（PRV）PCR检测程序11猪细小病毒（PPV）PCR检测程序13猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）PCR检测程序15细菌学检测程序1717猪瘟RT-PCR检测程序一、病毒RNA的提取1、阳性对照RNA的提取材料冻干猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。方法将1瓶猪瘟兔化弱毒冻干疫苗用1.5ml蒸馏水或PB

2、S液稀释，用1mlRNase-free管分装，每管500µl，-20℃保存。取出冻存的猪瘟病毒，解冻后离心，取上清用于RNA的提取。RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50µlRNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。2、疑似病料RNA的提取样品采集采集病死或扑杀的猪，取血清、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、肾脏、流产胎儿等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5ml，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于

3、新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mlPBS（PH7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。RNA提取待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50µlRNAase-free水溶解RNA，得到R

4、NA溶液。二、RT-PCR反应1、材料RT试剂盒（东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。引物序列：F：5’-GACCTGGATGCGACTGACC-3’,19bp，TM为61.88。R：5’-GCGGCGAGTTGTTCTGTTAG-3’,20bp，TM为59.85。扩增的目的片段为133bp。2、RT体系及反应程序：名称弱毒疫苗阳性对照检测病料RNase-Free水6µl0特异性下游引物1µl1µl模板RNA5µl11µlTotal12µl12µl置于PCR仪上65℃10min，立即冰浴5min

5、。然后加入以下试剂：17变性后的RNA溶液12µl5×RTbuffer4µldNTPmixture2µlRNaseInhibitor1µlReverTraACE1µlTotal20µl按以下程序反转录：1、42℃，45min2、99℃,5min将cDNA-20℃保存。2、PCR反应体系及程序ddH2O7.5µlcDNA3µl上游引物1µl下游引物1µl2×Mastermix12.5µlTotal25µl反应程序：1、94℃，3min2、95℃，30sec3、56℃，30sec×35cycles4、72℃

6、，1min5、72℃，10min三、电泳用TAE电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶，100ml加入5µl染色液。80V/70Ma电泳40min观察结果，在阳性对照出现133bp条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现133bp的条带，判定为猪瘟病毒阳性。17猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序一、病毒RNA的提取1、阳性对照RNA的提取材料冻干PRRS弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。方法将1瓶PRRS弱毒冻干疫苗用2ml生理盐水或PBS液稀释，用1mlRNAase-free管

7、分装，每管200µl，-20℃保存。取出冻存的病毒，解冻后用于RNA的提取。RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50µlRNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。2、疑似病料RNA的提取样品采集病死或扑杀猪，取病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结和肺脏样本）；待检活猪，用注射器取血5ml，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检

8、测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。胎儿的保存方法同上。组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mlPBS（pH7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。RNA提取待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50µlR