常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制

《常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制一、RNA病毒（蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒等）包括病料的处理、RNA的提取、反转录、和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。1、病料的处理取组织病料约2克，加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水，置研磨器（灭菌）中研磨或者用剪刀细心剪碎，置-20℃中反复冻融三次，即可用于检测。2、RNA的提取1）取上述冻融三次的病料约200微升置1.5毫升的离心管中，加入500-600微升TRIzol剧烈振摇30秒后，静置5分钟后，再次剧烈振摇30秒后，静置5分

2、钟。2）在加入200微升的氯仿，上下颠倒混匀30s，静置5分钟，4℃12000g离心15min。离心完毕后，取上清约400-500微升（注意不要吸到中间层白色物质）置新的灭菌好的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒数次后（不可剧烈震动）静置10分钟，4℃12000g离心10min.可见管底部有少量白色沉淀，倒掉异丙醇，加入1毫升75％的乙醇（DEPC水配制），振摇，将白色沉淀悬浮，4℃7500g离心5min。弃去上清，干燥沉淀物（将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上，室温约5min即可）加入20μLDEPC水溶解用

3、于RT-PCR，或于-20℃保存备用。两步法：1、反转录在10μL的反转录体系中加入：上述步骤中提取的RNA7μL、5×Buffer2μL、10mMdNTP0.25μL、Oligo(dT)180.5μL或者下游引物0.5μL；65℃10分钟，迅速放置-20摄氏度冰箱中2分钟，加入M-MLV100U/μL0.25μL（反转录酶）37℃水浴1h,即可做为PCR扩增的模板，立即用于PCR扩增或置于-20℃保存备用。2、PCR扩增设立阳性和阴性对照，阳性对照一般为病毒液，阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。反应总体

4、系为25μLcDNA2μL，（模板）25mmol/LMg2+1.5μL，2.5mmol/LdNTPs2.0μL，10×Mg2+freePCRBuffer2.5μL，20mmol/L上下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL无菌双蒸水补至25.0μL。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，共进行36个循环；最后72℃延伸10min。（根据不同的病毒设定时间和温度）一步法：采用的是TaKaRa的PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer

5、.2试剂盒在25uL反应总体系：<1>PrimeScript1StepEnzymeMix,1uL<2>2×1StepBuffer，12.5uL<3>RNaseFreedH2O,6.5ul<4>20mmol/L上下游引物各1μL，<5>提取的RNA模板：3ul反应条件：50℃反转录30min，94℃预变性2min，进行30个循环（94℃变性1min，56℃退火1min,72℃延伸1min）,最后72℃延伸10min。扩增完的PCR产物放4℃保存。1、凝胶电泳1%琼脂糖凝胶的配制0.25琼脂糖+25毫升TAE+1.2

6、5微升Goidview放入锥形瓶中，置烤箱中约1分钟沸腾后，摇匀，放置室外，约20-30分钟后倒入板中，约30-45分钟凝固后即可使用。点样：将凝胶放入电泳槽中，DL2000的DNAMarker3-5微升，其它样品5微升+0.5-1微升的londingbuffer混合后点样，开启电泳仪，电压80-150V。2、PCR产物回收纯化取20μLPCR产物与4μL6×LoadingBuffer混匀，1%琼脂糖凝胶（GoldView0.5ug/ml）电泳。电泳结束后，在紫外灯下切出含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽

7、凝胶表面的电泳缓冲液，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的多余凝胶以减小凝胶体积，从而提高DNA的回收产率。之后按照胶回收试剂盒产品说明书回收目的片段，并取1μL回收产物点样观察回收效果。纯化步骤如下：(1)称量胶块重量，计算胶块体积，按照1mg等于1μL计算胶块体积；(2)向胶块中加入3倍胶块体积的融化液DR-IBuffer；(3)均匀混合后65℃水浴10min，其间摇晃3-5次使胶块完全溶化；(4)向上述胶块融化液中加入DR-IBuffer0.5倍体积量的DR-IIBuffer，均匀混合；(5)转移液体至S

8、pincolumn中，12,000rpm离心1min，弃滤液（可将滤出液体回收再离心一次以提高DNA回收率）；(6)将500ul的RinseA加入Spincolumn中，12,000rpm离心30s，弃滤液；(7)将700ul的RinseB加入Spincolumn中，静置2－3min，12,000rpm离心30s，弃滤液；(8)重复上一步操作；(9)10,000rpm，离