猪流行性腹泻病毒分离鉴定与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、动物医学进展，2014，35(8)：31—35ProgressinVeterinaryMedicine猪流行性腹泻病毒分离鉴定与实时荧光定量RT—PCR检测方法的建立唐金明。，陈书琨，林庆燕，黄新亚。，卢体康，孙洁，阮周曦，曾少灵，祁振强，吕建强，杨俊兴，曹琛福，张彩虹，刘建利，廖立珊，花群义，秦智锋¨(1．深圳出入境检验检疫局，广东深圳518045；2．华南农业大学，广东广州510642；3．湖南农业大学，湖南长沙410000；4．深圳市宝舜泰生物医药股份有限公司，广东深圳市518001)摘要：采用Vero-76细胞系从临

2、床样品小肠内容物中分离到1株猪流行性腹泻病毒(PEDV)，通过RT-PCR进行了鉴定。针对PEDV，参照保守的M基因序列设计了特异性引物和探针，建立了针对PEDV特异性的实时荧光定量RT_PCR检测方法(PEDV-rRT—PCR)。所建立的方法特异性强，与传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪细小病毒等猪主要病原体无交叉反应；方法灵敏度高，检测灵敏度达到重组质粒1O稀释度(约20cop)；重复性好，组内变异系数≤0．26。20份田间样品检测结果表明，所建立的PEDV-rRT—PCR方法快速、灵敏，检测结果准确可靠，适合用于PEDV的

3、快速检测和流行病学调查。关键词：猪流行性腹泻病毒；病毒分离；实时荧光定量RT—PCR中图分类号：$852．28；$852．659．6文献标识码：A文章编号：1007-5038(2014)08—0031—05猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，个州，造成了严重的经济损失。PEDV与猪传染性PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdi—胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，arrheavirus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性TGEV)

4、、轮状病毒A(RotavirusgroupA，Rota—A)肠道传染病，主要临床表现为腹泻、呕吐、脱水和哺感染后所引起的临床症状相似，临床难以鉴别诊断，乳仔猪高致死率。PED呈世界范围性流行，1971年给疾病的确诊、治疗和防控带来了很大困难，给养猪在英国和比利首次报道，此后加拿大、匈牙利、德国、业造成严重经济损失。日本及韩国等多个国家都报道了该病的发生。中国2013年，从规模化养猪场采集2O多份临床样于1976年首次报道PED_1]。最近几年，PED危害品，采用Vero-76细胞系分离出了1株PEDV，并通性进一步加大，流行

5、呈明显上升趋势口_3]。从2010过RT—PCR方法和测序对其进了鉴定。为建立年春季至今，我国的很多省份、泰国、菲律宾、韩国及PEDV的快速检测方法，采用实时荧光定量RT-美国等国家的规模化猪场暴发严重的猪流行性腹泻PCR(real-timeRT—PCR，rRT—PCR)技术建立一种疫情。2013年，猪流行性腹泻病毒已蔓延美国13能快速、灵敏、准确检测PEDV的实时荧光定量RT一收稿日期：2013-12—27基金项目：深圳市技术创新计划资助项目(CXZZ2013032o154210829)作者简介：唐金明(1986一)，男，

6、湖南永州人，助理兽医师，硕士，主要从事动物疫病检测工作。*通讯作者岽豢米DevelopmentandApplicationofSemi-nestedPCRforOrfVirusDetectionDENGYu(SchoolofAnimalScience，XichangCollege，Xichang，Sichuan，615013，China)Abstract：AceordingtothesequenceofFILgeneofOrfvirusinGenBank，threeprimersweredesignedandsynthesi

7、zed．Asemi—nestedPCRassayfordifferentiatingOrfvirus(ORFV)，sheeppoxvirus(SPV)andgoatpoxvirus(GPV)wasdeveloped．The450bpDNAfragmentwasamplifiedinORFVXC13strain，butnobandswereamplifiedwithtemplatesextractedrespectivelyfromSPV，GPVandavianpoxvirus．Sensi—tivityofthesemi—ne

8、stedPCRassaywas3．64×10copies／／,LORFV．Intherepeatabilitytestandthefieldtrail，thesemi—nestedPCRassaycouldbeusedasamethodforthedetectionandmolecular