荧光定量PCR检测2型猪圆环病毒方法的建立-论文.pdf

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1、·28·试验研究广东畜牧兽医科技2014年(第39卷)第1期荧光定量PCR检测2型猪圆环病毒方法的建立敖艳华，穆光慧，郭沈涛，齐冬梅，张毓金(广东永顺生物制药股份有限公司，广东广州511356)摘要：通过克隆2型猪圆环病毒(PCV2)的开放阅读框2(0RF2)基因编码其核衣壳蛋白(Cap)的一段靶序列，构建重组质粒作为标准阳性模板。根据GenBank中的靶序列设计一对引物和一条TaqMan探针。对PCR反应条件优化后，对构建的标准阳性模板定量，然后10×倍比稀释进行荧光定量PCR(qPCR)扩增并制作标准曲线，初步建立了PCV2检测的

2、qPCR方法。结果表明，该方法检测灵敏度可达1．0×102拷贝／L，线性范围为10～10，达9个数量级，并且具有很好的特异性。对起始浓度为1．0×108、1．0×106、1．0X104拷贝／“L的标准品的最终实际测得cT均值分别为12．77、19．72和26．89；变异系数分别为0．25％、0．1O％和0．13％，均小于1％，说明此方法具有艮好的准确性和重复性。关键词：猪圆环病毒；荧光定量PCR；TaqMan探针中图分类号：$852．659．2文献标识码：A文章编号：1005—8567(2014)01—0028—04Developme

3、ntofaReal—timePCRAssayforDetectionofCircovimsType2AoYanhua，MuGuanghui，GuoShentao，QiDongmei，ZhangYujin(GuangdongWinsunBio—PharmaceuticalCo．，Guangzhou511356，China)AbsWact：ThepartofORF2sequenceofPCV2wasclonedintovectorpMD19一T，andtherecombinedplasmidwasconstructedandusedass

4、tandardpositiveconfoltemplate．AccordingtothepublishedsequenceofPCV2inGenBank,apairofprimersandaTaqManprobeweredesigned．Areal—timePCRassayusingquantitativeconcentrationsofsefial10folddilutionsofrecombinedplasmidDNAasstandardswasdevelopedbyoptimizingcirculationparameters．

5、Astandardcurvewasachievedandtheresultshowedthatthesensitivityofthismethodwas1．0×l0copies／pLandthelinearrangewas1O～10．Ctvaluesofinitialconcentrationsof1．0x101．0×106and1．0×l0copies／pLwere12．77，19．72and26．89；Andthevariationcoe伍cientswere0．25％。0．1and0．13％respectively,allbel

6、ow5％．Takentogether,ourresultssuggestthatthismethodishighlyspecific．sensitiveandrepeatable．Keyw0rds：Porcinecircovirus；real—timePCRTaqManprobe猪圆环病毒(porcinecircovirus，PCV)属weaningMultisystemicWastingSyndrome，于圆环病毒科(circoviridao)圆环病毒属，是迄PM＼vS)的主要病原[3]。其他协同因素如与猪瘟病今为止发现的最小的病毒

7、，其粒子直径最小，仅毒(CSFV)或者猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)17nm，DNA基因组长1．7kb，目前只发现其有1等混合感染可增强该疾病的严重程度。PCV2及个分子量为30kD的蛋白质Eli。病毒粒子为二十其相关的猪病，可造成10％~30％不等的死亡率，面体对称、无囊膜、单股环状DNA病毒嘲。较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40％，因现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。而给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各PCV1为非致病性的病毒；PCV2为致病性的病毒，国的兽医与养猪业者认为是继猪繁殖与呼吸综它是引起断

8、奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-合征之后另一个危害极其严重的猪病。收稿日期：2013-11—27：通讯作者荧光定量PCR检测2型猪圆环病毒方法的建立一敖艳华，等试验研究·29·目前，对于PCV2的检测和鉴定方法有ELI