以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立-论文.pdf

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1、-140·中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2014Jan；30(1)：140—3网络出版时间：2013—12—2006：19网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20131220．0619．031．html◇实验方法学◇以Insig一2基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立张·琴，杨发建，何芸，杨俊霞(重庆医科大学药理学教研室，重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆400016)doi：10．3969／j．issn．1001—1

2、978．2014．01．031平衡中发挥着重要的作用。双荧光素酶报告基因检测系统文献标志码：A文章编号：1001—1978(2014)01—0140—04是目前从分子水平用于研究分析基因转录调控的有效工具，中国图书分类号：R394—3；R394．2；R965．1；R589．2；R972．6；具有快速、灵敏、简便、不需要使用放射性同位素、可重复的R977．3消除预测结果假阳性等优点。目前国内外尚未见基于该摘要：目的通过双荧光素酶报告基因检测系统建立以胰岛方法的以Insig-2基因为靶点的脂质代谢类药物筛选模型的素诱导基因2(insu

3、lin—inducedgene2，Insig一2)启动子为靶点报道。的药物筛选模型。方法将人Insig一2基因启动子序列克隆本研究通过构建重组质粒pGL3一Insig一2，将其与内参质入荧光素酶报告基因载体pGL3一basic中，构建重组质粒粒pRL—TK瞬时共转染工具细胞，调节共转染质粒比例，处pGL3一Insig-2并与内参质粒pRL—TK瞬时共转染工具细胞，以不同药物进行比较，构建以Insig一2基因启动子为靶点的药物筛选模型，为进一步研究Insig一2基因表达的作用机制通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映Insig-

4、2基和筛选以Insig-2基因启动子为靶点的脂质代谢类药物奠定因启动子启动转录的活性，并对共转染质粒比例、工具细胞基础。选择等条件进行探索和优化，相关药物处理进行验证。结果成功构建了重组质粒pGL3一Insig-2；确认pGL3一Insig-2：1材料与方法1．1细胞和试剂HEK293人胚肾细胞和HepG2人肝癌细pRL—TK共转染比例为4：1，确定3T3一L1细胞为工具细胞；胞由重庆医科大学生物化学与分子药理学重点实验室保存，1，25一(OH)，D、小檗碱和姜黄素均能明显增强Insig一2基因333一L1前脂肪细胞购自中国科学院

5、上海生命科学研究院细启动子活性。结论成功建立了以Insig一2基因启动子为靶胞资源中心。限制性内切酶KpnI、MluI、T4DNA连接酶点的药物筛选模型，为筛选新型调脂药奠定基础。购自TOYOBO公司；Lipofectamine2000试剂购自Invitro—gen公司；质粒pGL3一basic和pRL—TK、Dual—LuciferaseRepoa—关键词：Insig一2；启动子；药物筛选；报告基因载体；调脂药；erAssaySystem购自美国Promega公司。1，25一(OH)2D3购荧光素酶法自Sigma公司，盐酸小檗碱

6、购自重庆鼎国生物技术有限公司，姜黄素由重庆医科大学生物化学与分子药理学重点实验胰岛素诱导基因2(insulin—inducedgene2，Insig一2)是室保存。Yabe等⋯通过生物信息学技术与Insig．1比较而发现的调控1．2构建重组质粒将人Insig一2基因启动子片段连接到脂肪分化与脂质代谢的新基因，主要在肝脏和脂肪组织中表pTA2载体中，转化感受态大肠杆菌DH5c~，筛选阳性克隆，达，两者序列同源性为59％。其编码的INSIG-2蛋白是一种提取质粒pTA2一Insig一2。用限制性内切酶MluI和KpnI双内质网膜结合蛋

7、白，通过与胆固醇调节元件结合蛋白(sterol酶切pTA2．Insig一2后并纯化，克隆至经MluI和KpnI双酶regulatoryelementbindingproteins，SREBPs)及SREBPs裂解切的pGL3一basic载体，以T4DNA连接酶16℃连接过夜，连活化蛋白(SREBPcleavageactivatingprotein，SCAP)结合，以接产物转化感受态大肠杆菌DH5ct，双酶切鉴定筛选阳性克INSIG一2一SREBPs—SCAP复合物形式附着在内质网上，阻止隆，获得重组质粒pGL3-Insig一2，送

8、至重庆金麦公司进行SCAP护送SREBPs至高尔基体，阻断SREBPs在高尔基体中DNA测序鉴定。裂解活化，从而抑制脂肪细胞分化及脂质合成，此外Insig一1．3重组质粒转染细胞取对数生长期HEK293人胚肾细2还可促进胆固醇合成中的限速酶HMG—