叶酸-壳聚糖偶联物的制备及对人体血红细胞的影响-论文.pdf

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1、第29卷，第3期光谱实验室V01．29，No．32012年5月ChineseJournalofSpectroscopyLaboratoryMay，2012叶酸一壳聚糖偶联物的制备及对人体血红细胞的影响①蔡树山刘宗华②陈莉莉张渊明薛巍口(暨南大学化学系广州市黄埔大道西601号510632)6(暨南大学生命与健康工程研究院广州市黄埔大道西601号510632)c(中山市东区中学中山市孙文东路齐乐路3号528403)摘要通过叶酸活性酯与壳聚糖的氨基反应，制备出叶酸一壳聚糖偶联物；经红外光谱、核磁共振表征该偶联物的化学结构，紫外分光光度法测定每个壳聚糖上叶酸的接枝量。通过溶血实验、

2、扫描电镜、原子力显微镜观察比较了壳聚糖、叶酸一壳聚糖对人体红细胞的影响。结论：成功制备出叶酸一壳聚糖偶联物；与壳聚糖相比，接枝叶酸的壳聚糖对血红细胞的形貌没有改变。关键词叶酸-壳聚糖偶联物；人体红细胞；形貌中图分类号：0636．9；0657．61文献标识码：A文章编号：1004—8138(2012)03—1702—051引言叶酸一叶酸受体靶向是近年来倍受青睐的一种新型抗肿瘤机制。通过配体一受体作用可将基因、药物靶向导人高表达叶酸受体的病理组织和细胞中，而正常细胞不受影响，从而大大增加了治疗的安全性和有效性。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基衍生物，具有生物相容性好、可生物降解性、免疫

3、活性低的特点，在生物材料、医学等领域的应用备受关注Ⅱ]。因此，通常将叶酸与壳聚糖偶联，用作有靶向功能的基因／药物载体乜。]。以医疗为目的的基因／药物载体的一个重要的特征是与生物系统直接接触，并往往与血液接触或通过血液输送，合理评价生物材料对血液成分及形态的影响一直是材料工作者极为关注的研究方向，且叶酸一壳聚糖偶联物对人体血红细胞的影响未见报道。本文在成功合成叶酸一壳聚糖偶联物的基础上，通过红细胞溶血实验、扫描电镜、原子力显微镜表征手段比较了壳聚糖接枝叶酸前后对红细胞溶血及形貌的影响。2实验部分2．1试剂与仪器叶酸(美国Sigma公司，≥97)；壳聚糖(浙江金壳生化有限公司，

4、脱乙酰度≥9o，分子量~50kDa)；1一(3一二甲氨基丙基)一3一乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HC1，纯度>98．59／6，上海晶纯试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯未经过任何处理。实验用水为三次蒸馏水。TU一1810型紫外一可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；LGJ一12型冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；ZeissAxioScopeA1型显微镜(德国蔡司公司)；①广东省自然科学基金(1ol5l06320100OolO)；广州市科技计划项目(iiC32O7O752)②联系人，电话；(O2O)85225o36；E—mail：834961663@qq．

5、corn作者简介：蔡树山(1987一)，男，广东省梅州市人，硕士，主要从事生物材料研究工作。收稿日期：2012—03—09；接受日期：2012—03—21第3期蔡树山等：叶酸一壳聚糖偶联物的制备及对人体血红细胞的影响PhilipsXL一30型扫描电镜(荷兰飞利浦公司)；Veeco／BrukerMultiMode8型原子力显微镜(美国仪器集团)Equinox55型傅里叶红外光谱仪(德国布鲁克公司)；Avance300型核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)。2．2实验方法2．2．1叶酸偶联壳聚糖(FA—CS)的制备和纯化叶酸和EDC·HCI(摩尔比为1：1)溶解于20mL的无水DMSO

6、中，在室温下磁力搅拌至完全溶解，即得红棕色的叶酸活化酯DMSO溶液；然后将叶酸活化酯溶液缓慢滴入0．5％(w／v)壳聚糖的醋酸溶液(pH4．7)，室温避光搅拌16h；将反应后的溶液用0．1mol／LNaOH溶液调pH至9，室温2500r／min下离心5min，沉淀物分别在PBS(O．1mol／L，pH4．7)缓冲液中透析3天，在三次水中透析4天，冷冻干燥。2．2．2叶酸偶联壳聚糖(FA—CS)的表征取壳聚糖和叶酸壳聚糖偶联物冻干粉，分别与溴化钾在玛瑙钵中一起研磨，压片，在傅里叶红外光谱仪中进行红外光谱测试。叶酸壳聚糖偶联物的化学结构使用氘代醋酸／氘代水(v／v，1：3)溶剂

7、在核磁共振仪上进行分析。2．2．3血红细胞分离与提取取健康人血液样本，在室温下3000r／min离心3min，小心弃出上层的血清和自细胞，分装于50mL干燥离心管内，加PBS(pH7．4)缓冲液使血球密度为10，3000r／rain离心5min。弃上清液，重复前述操作5次，直至上清液基本无色，弃上清液，剩余的红细胞用PBS(pH7．4)缓冲液配成1O(v／v)的红细胞悬液，4℃保存。2．2．4溶血实验在新制备的红细胞悬液中加入不同剂量壳聚糖和叶酸壳聚糖偶联物，终浓度为0．005、0．01、0．05、0．1、0．5、