不同连接比例叶酸偶联壳聚糖的制备

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1、不同连接比例叶酸偶联壳聚糖的制备【关键词】叶酸;壳聚糖;偶联;基因治疗　　ABSTRACT:ObjectiveTocouplefolateinegrouponthechitosan.ThenthefolatecoupledchitosanberoffolatesineachofthechitosanseasuredbyUVspectrophotometry.ResultsInfraredspectroscopyshoberoffolatesineachchitosanately3,10,20and30.

2、ConclusionCouplingoffolateL/L醋酸溶解，滴加氨水使其沉淀，沉淀用去离子水洗涤至中性，冷冻干燥得到纯化的壳聚糖[3]。　　1.2.2壳聚糖脱乙酰度的测定准确称取0.25g干燥至恒重的壳聚糖，置于250mL三角瓶中，加入20mL标准0.1mol/L盐酸溶液，室温磁力搅拌1h至全溶，加入10mL蒸馏水稀释，滴加3滴10g/LIKI指示剂。在磁力搅拌下，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至亮紫色颗粒状沉淀出现(充分振荡不溶解)即为滴定终点[45]。重复测定3次取平均值，按以下公

3、式计算脱乙酰度：　　NH2%=(C1V1-C2V2)×0.016G×100　　式中C1：盐酸标准溶液的浓度(mol/L);C2：氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L);V1：加入的盐酸标准溶液的体积(mL);V2：滴定消耗的氢氧化钠标准溶液体积(mL);G：样品质量(g);0.016：与1mL、1mol/L盐酸溶液相当的氨基量(g)。　　脱乙酰度(D.D.)/%=NH2%9.94%×100　　1.2.3叶酸偶联壳聚糖(FACS)的制备和纯化①叶酸活性酯的制备：称取叶酸，用10mLDMSO溶解，再加入5倍量

4、的EDC，25℃避光搅拌1h，即得红棕色的叶酸活性酯的DMSO溶液[67]。②叶酸偶联壳聚糖的制备：称取壳聚糖溶解于5mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.7)中，磁力搅拌条件下缓慢加入叶酸活性酯的DMSO溶液，30℃下避光反应16h，然后用NaOH调pH至9.0。③叶酸偶联壳聚糖的纯化：混合液首先在pH为7.4的磷酸盐缓冲液中透析3d，再在双蒸水溶液中透析3d，修饰后多聚物用冷冻干燥法分离收集备用[8]。　　1.2.4叶酸与壳聚糖偶联的验证取叶酸、壳聚糖和叶酸偶联壳聚糖冻干粉，分别与溴化钾在玛瑙钵中一起研磨

5、，压片，在傅立叶红外光谱仪中进行红外光谱测试。　2结果　　2.1壳聚糖脱乙酰度的测定在壳聚糖脱乙酰度的测定方法中，以酸碱滴定法最简便快速、成本低廉、准确度较高，但在指示剂的使用中发现，用甲基橙和甲基橙苯胺蓝混合指示剂时终点变化不明显，误差较大。因此选择IKI指示剂，测定壳聚糖脱乙酰度为91.79%。　　2.2叶酸与壳聚糖偶联的验证图1～3显示，在叶酸偶联壳聚糖的红外光谱图中，3444cm-1左右的峰是OH的伸缩振动吸收峰与NH的伸缩振动吸收峰重叠而成的多重吸收峰。图3中1563cm-1左右出现了一

6、个新的吸收峰，表明壳聚糖的游离氨基与叶酸的羧基形成了酰胺键。　　2.3叶酸标准曲线的制备叶酸在5.15～30.9μg/mL范围内与吸光度(A)呈良好的线性关系。回归方程为A=0.0127C+0.0116，r=0.9983。　　2.4不同连接比例叶酸偶联壳聚糖的制备当叶酸活性酯与壳聚糖分子上游离氨基的比例为1∶1时，每个壳聚糖上连接叶酸的最大量大致为46个。根据文献报道，在叶酸蛋白质偶联物上平均一个蛋白质分子上偶联3个叶酸分子已有较强的靶向性[9]。因此，改变叶酸、壳聚糖、EDC的用量，制备了每个壳聚糖上

7、连接叶酸的量大致为3、10、20、30个的叶酸偶联壳聚糖(表1、表2)。表2叶酸偶联壳聚糖偶联比的测定　　3讨论　　与其他受体介导的基因投递方式相比，叶酸受体系统有其独特的优点：①不需合成和纯化配体蛋白，如转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白，无其他配体所致的潜在免疫原性;②结构相对简单，有明确的化学交联特性，容易合成;③体积较小，药代动力学特征更好，可重复给药;④仅在肿瘤细胞高表达，在正常组织无或很少表达，故具有很好的肿瘤组织特异性;⑤在人类一系列肿瘤中均有叶酸受体的高表达，靶向应用的范围很广[10]。因此，这种利

8、用叶酸为靶弹头，结合药物/DNA，通过与叶酸受体特异结合而将药物靶向投递到肿瘤组织的靶向投递系统正倍受关注[11]。　　本实验利用壳聚糖氮原子上的酰化反应，通过叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应制得叶酸偶联壳聚糖。叶酸是一个弱酰化剂，可加入缩合剂以提高反应活性。缩合剂首先与叶酸生成活性中间体，进一步与胺作用则得酰胺[12]。常用的此类缩合剂有二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和EDC等。考虑到EDC是水溶性缩合