酵母双杂交系统的改进与研究进展.pdf

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1、文章编号!1003-6482"2006#01-0108-09酵母双杂交系统的改进与研究进展。张莉1$2$黄倢1。1.中国水产科学研究院黄海水产研究所9青岛26607132.莱阳农学院植物保护系9青岛266109)摘要!酵母双杂交系统是一种新兴的体内研究蛋白质之间相互作用以及筛选cDNA文库的技术手段!自建立以来得到了不断的改进与发展"在此基础上又相继出现了单杂交#三杂交#反向双杂交以及SOS富集系统等多种衍生系统!它们在功能基因组学#蛋白质组学以及药物开发研究中发挥了重要作用"本文拟就双杂交系统的原理#改进#发展及应用做一综述"关键词

2、!酵母双杂交系统$单杂交系统$三杂交系统$反向双杂交系统$SOS富集系统中图分类号!T0920.1文献标识码!A随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成9基因工程领域又迎来了一个新的时代功能基因组时代9它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识O生物体系的运作是与蛋白质之间的相互作用密不可分的9如DNA合成基因转录启动蛋白质翻译修饰和定位以及信息传导等重要生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用O能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步O酵母双杂交系统yeasttwo-h

3、ybridsystem)是用于研究蛋白质之间相互作用的一种崭新的有效1的遗传学方法O是由Fields和Song在1989年首创的9它利用转录启动报告基因9以已知功能蛋白作为诱饵蛋白Baitprotein)9从相应的cDNA文库筛选出与之相互作用的蛋白9而不需要蛋白的纯化9比以往研究蛋白质之间相互作用的生化技术如偶联免疫共沉淀以及亲和层析等更具有优越性O经过十多年的发展9国外学者又创立了基于双杂交原理的新系统如单杂交系统三杂交系统反向双杂交系统以及核外双杂交技术等9使人们对研究生物大分子之间的相互作用扩展到蛋白质与核酸之间以及核

4、酸与核酸之间O其功能也被推广到细胞周期调控信号转导肿瘤基因表达等多个研究领域9它在水产养殖病害防治中也得到了越来越广泛的应用O1酵母双杂交系统的基本原理酵母双杂交系统的产生是基于对真核细胞转录启动因子如酵母转录因子GAL4性质的1研究O其原理如图1所示IGal4蛋白可识别专一的位点UASupstreamactivationse-G。基金项目I国家重点基础研究发展规划项目课题资助G1999012002)国家自然科学基金项目30271020)青岛市自然科学基金项目03-2-JZp-10)山东省自然科学基金项目G2002D02)和

5、中国水产科学研究院科研基金项目2003-青-6)共同资助。通讯作者I黄倢9博导9研究员O从事海洋生物病毒学研究TelI0532-85823062E-mailIaCudis2000＠ysfri.ac.cn第一作者简介I张莉1973-)9女9硕士研究生9主要从事分子病毒学研究收稿日期I2005-03-021期酵母双杂交系统的改进与研究进展109Cuence并与之结合启动下游GAL1-lacZ基因的转录GAL4在结构上是组件式的modu-lar由两个在结构上可以分开而在功能上又相互独立的结构域组成其N末端1～147个氨基酸构成DNA结合结构

6、域BindingDomainBD单独的BD不能启动下游靶基因的转录而当它与靶基因启动子内特异的核苷酸序列结合后即能激活基因的转录其C末端由768～881个氨基酸构成DNA激活结构域ActivatingDomainAD它只有结合到UASG上才具有启动转录的功能这两个结构域通过共价或非共价连接建立的空间联系使得它们只要在同一细胞内就能彼此靠近启动下游报告基因的表达根据这一特点使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y分别以和BDAD在空间结构上重新连接为一个整体而与报告基因的上游激活序列UAS结合进而发挥启动转录的功能使受调控的报告基因得以表达在

7、目前通用的系统中根据BD来源不同可分为GAL4系统和LeXA系统真核细胞中的是GAL4系统原核细胞中的是LeXA系统其转录启动因子是LeXA1Fields等以与调控SUC基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型设计了一个检测蛋白-蛋白相互作用的双杂交系统将Snf1与BD融合Snf2和AD融合构建在穿梭质粒上Snf1是一种依赖于丝氨酸苏氨酸的蛋白激酶Snf2是其结合蛋白把两种穿梭质粒转化酵母GGY171菌株该菌株含有LacZ报告基因并且已去除了相应的转录因子基因此结果表明由Snf1和Snf2的相互作用使AD和BD在空间上相互靠近从而

8、启动报告基因LacZ的转录利用此原理我们可构建两个重组质粒将感兴趣的蛋白基因转入带有BD结构域的质粒载体中并把其转入酵母细胞中表达一个融合蛋白诱饵蛋白bait把要筛选的cDNA文库转入带有AD结构域的另一质粒载体中表达另