临床医学论文结核分枝杆菌HSP 65亚单位疫苗和基因疫苗的构建及免疫学特性.doc

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1、临床医学论文■结核分枝杆菌HSP65亚单位疫苗和基因疫苗的构建及免疫学特性作者：席丽，师长宏，靳亚平，张海，张廷芬，赵勇，岳晨莉【摘要】冃的：构建HSP65蛋白的亚单位疫苗和基因疫苗，并与BCG相比较，评价这两种疫苗在小鼠体内的免疫学特性.方法：从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出hsp65基因，连接进入pMD18T载体中，测序后，利用不同酶切位点将完整的hsp65基因分别克隆到pProEXHTb原核表迖载体和pcDNA3.1(-)真核表达载体，前者在大肠杆菌中诱导表达，经SDSPAGE和WesternBlot分析后，用NiNTA亲和层析柱进行纯化；后者通过阳离子聚合物

2、瞬转P815细胞，用间接免疫荧光检测细胞内HSP65蛋白的表达•用上述原核表达蛋白和真核质粒(分别为亚单位疫苗和基因疫苗)•免疫BALB/c小鼠，ELISA测定特异性抗体的滴度，MTT测定脾淋巴细胞特异性增殖指数.结果：获得的结核分枝杆菌hsp65基因序列与GenBank公布的完全一致；WesternBlot结果显示5在Mr约65000处有与鼠抗HSP65mAb和临床结核患者血清的特异性结合带；免疫荧光结果显示转染重组质粒的P815细胞的表达蛋白与HSP65mAb有特异性结合.两种疫苗免疫小鼠体内产生特异性抗体，经蛋白刺激后可引起脾淋巴细胞特异性增殖.结论：所构建的两种疫

3、苗能引起免疫动物的特异性体液和细胞免疫反应，应进一步硏究其抵抗结核分支杆菌感染的保护力机制，以用于结核病的防治硏究.【关键词】结核分枝杆菌；热休克蛋白质类；亚单位疫苗；基因疫苗[Abstract】AIM:ToconstructthesubunitvaccineandDNAvaccinebasedonheatshockprotein65(HSP65)ofM.tuberculosisH37Rv(MTB)andtoevaluatetheimmunologicalproperties・METHODS:Thegeneofhsp65wasamplificdfromDNAgenomeo

4、fMTBH37Rvstrainbypolymerasechainreaction(PCR).ThePCRproductwasinsertedintopMD18Tvectorandsequenced・TheHSP65genesegmentwassubclonedintoprokaryoticexpressionvectorpProEXHTbandeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(・)respectively.TheformerwasexpressedinE.coliDH5a・ThetargetproteinwasidentifiedbyS

5、DSPAGEanalysisandbyWesternBlotwithmonoclonalantibodyagainstMTBHSP65andserafromclinicalTBpatients・Recombinant6xHisfusedproteinwaspurifiedbyNiNTApurificationsystem;theeukaryoticrecombinantplasmidwastransfectedintoP815cellsbySuohuasofasttransfectionreagent,andtheexpressionwasidentifiedbyindi

6、rcctimmunofluoresccnttechnology.RESULTS:ThesequenceofPCRproductwasidenticalwiththatofHSP65geneinGenBank.RelativemolecularmassidentifiedbySDSPAGEanalysiswasconsistentwithwhathadbeenreported,whichwasalsoconfirmedbyWesternBlotanalysisthattherewasaspecificbandat65000withthespecificmonoclonala

7、ntibodyagainstMTBHSP65andTBpatientssera,andtherewasaspecificbandbetweenproteinsexpressedbytransfectedP815andtwoantibodiesabove.CONCLUSION:ThetwovaccinesofHSP65aresuccessfullyconstructedandpossesstheimmunologicalproperties.Itwi11behelpfulinfurtherstudiesondiagnosisan