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1、132心肺血管病杂志2015年2月第34卷第2期JournalofCardiovascular&PulmonaryDiseases~February2015,Vo1.34,No.2DOI:10.3969/j.issn.1007-5062.2015.02.015基础研究·人真皮微血管内皮细胞的原代培养及低氧/复氧模型的建立鲁昆王月丽王海红关啸王绿娅辛毅褚小玲林煌[摘要]目的:培养人真皮微血管内皮细胞,建立人真皮微咀管内皮细胞低氧/复氧模型。方法:采用酶消化及联合磁珠分选法,得到人真皮微血管内皮细胞(HDMECs),体外培养传至P5代,采用Ⅷ因子免疫荧光及CD309、CD34流式细胞学进行鉴
2、定。用缺氧Buffer加低氧舱的方法低氧处理P5代HD—MECS。实验分为四组,Con组不做任何处理、H8组低氧8小时组,H8R12组低氧8小时复氧12小时组、H8R24组低氧8小时复氧24小时组。TUNEL(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)染色法检测细胞凋亡,蛋白质印迹法(WesternBlot)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶一3(Caspase一3)蛋白的表达。结果:联合法分离的细胞,经过2次CD31磁珠分选后,可见细胞短梭形,呈铺路石样。细胞传至P5,Ⅷ因子免疫荧光染色阳性率为(95-4-2.61)%。流式细胞仪检测CD309阳性率为(95.4±1.34)%;CD34阳性
3、率为(42.5±3.23)%。TUNEL染色、WesternBlot结果显示:H8组的细胞凋亡率和活化的Caspase一3表达高于Con组(P<0.05),H8R12组、H8R24组细胞凋亡率和活化的Caspase一3表达高于H8组(P<0.05)。结论:本研究采用磁珠分选的办法成功培养了HDMECs,并且建立了HDMECs低氧/复氧模型,为临床研究游离皮瓣缺血再灌注损伤机制提供实验基础。[关键词]人真皮微血管内皮细胞;低氧/复氧;细胞凋亡[中图分类号】R54[文献标志码】A[文章编号】1007-5062(2015)02-132-05Primaryculturedandestablish
4、mentofhypoxic/reoxygenationmodelofhumandermalmicrovascularendothelialcellsLUKun,WANGYueli,WANGHaihong,GUANXiao,WANGLvya,XINH,CHUXiaolin,LINGHuangUniversityofSouthChina,Hunan421001,China[Abstract]0bjective:Usingenzymaticdigestionandmagneticbeadseparationcombinedmethodtoex—tracttheflapmicrovaseular
5、endothelialcells,createanendothelialcellmodelofhypoia/reoxygenationmodelinvitro.Methods:usingenzymedigestionandcombinedmagneticbeadseparationmethodtogetpeopleflapmi—crovascularendothelialcellsculturespreadtotheP5Invitro,usedimmunofluorescenceandfluidcytologytoi—dentificationit.Adoptthemethodofoxy
6、genBufferwithlowoxygentankprocessingP5HDMECs,Experimentisdividedintofourgroups,Connotdoanyprocessing,H8grouphypoxia8hgroup,H8R12reoxygenation12haf-terhypoxiaof8h,H8R24reoxygenation24hafterhypoxiaof8h.PercentageofapoptosiscellswasdetectedbyTUNELstainingmethod(TdT—mediateddUTPNick—EndLabeling).Prot
7、einimprintingmethod(WesternBlot)detectionproteinexpressionofCaspase一3.Results:thecombinedmethodtoseparatecells,aftertwoCD31mag—neticheadseparation,andculturedinvitro,cellswerespindleshaped,apavingstone.ToP5,immunofluor
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