专题课题多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

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1、情境导引PCR诊断技术又叫多聚酶,链式反应技术，它采用分子技术,模拟核酸在体内的复制，从而判,定疾病病原体的种类，所以从本,质上来说，这是一种分子诊断方法。核心要点突破知能过关演练课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段基础自主梳理基础自主梳理一、PCR扩增的原理及条件1．概念：PCR即_______________，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。2．原理(1)DNA的热变性：在80～100℃的温度范围内，DNA_________结构解体，双链分开，这个过程称为_____。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会

2、重新结合成双链。多聚酶链式反应DNA双螺旋变性(2)子链的合成：①需要______；②合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。3．条件(1)______模板。(2)分别与模板DNA两条链相结合的两种引物。(3)A、T、G、C四种______________。(4)耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶。(5)需要稳定的_____和能严格控制_____的温控设备.引物DNA脱氧核苷酸pH温度思考感悟1．什么是引物？若要克隆DNA，应加入几种特定的引物？【提示】所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。DNA是由两条反向平行排列的脱氧核苷酸长链构成的。在DN

3、A扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。二、PCR反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为____、复性和延伸三步。1．变性：当温度上升到______以上时，双链DNA解聚为单链。2．复性：温度下降到_______左右，两种引物通过________________与两条单链DNA结合。3．延伸：温度上升到_____左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在_______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。变性90℃50℃碱基互补配对72℃DNA聚合酶思考感悟2．PCR循环过程中，变性温度

4、设置95℃，时间设置30s的原因是什么？【提示】变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增。变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。三、实验操作1．实验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控_____，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个___________代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管：总容积为0.5mL，实际上是进行离心的场所。(3)微量移液器：用于吸取转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头每吸取一种试剂后都要更换。温度恒温水浴锅2．操作步骤准备→____→混合→_____→反应。四

5、、操作提示1．为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行__________。2．所用的_________和酶应分装成小份，并在－20℃储存。五、DNA含量的测定1．原理：利用DNA在260nm的紫外线波段的______曲线来测定相应含量。2．计算公式：DNA含量(μg)＝50×(260nm的读数)×_____________。移液离心高压灭菌缓冲液吸收稀释倍数核心要点突破要点一PCR原理1．PCR扩增方向：为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(—OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸D

6、NA链，即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。2．PCR原理——DNA的热变性原理通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪器。3．生物体内DNA复制与PCR反应的区别体内复制PCR反应解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至90℃以上时，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72℃特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次相同

7、点生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行(2011年聊城高二检测)下列关于DNA复制和PCR的描述中，正确的是()A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链B．DNA复制不需要引物C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D．PCR扩增的对象是氨基酸序列【尝试解答】__C__例1【解析】由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，故DNA