电洗脱法和透析在紫菜腐霉PacBio全基因组测序DNA样品纯化中的应用.pdf

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1、第47卷第11期2017年11月中国海洋大学学报PERl0DICAL0F0CEANUNIVERSITY0FCHINA47(11)：047～052Nov．。2017电洗脱法和透析在紫菜腐霉PacBio全基因组测序DNA样品纯化中的应用。邹丹丹1’2，唐祥海1’2，莫照兰3，茅云翔1’2“(1．中国海洋大学海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东青岛266003；2．中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛2660033．农业部渔业资源可持续发展重点实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东青岛266071)摘要：紫菜腐霉(助如i甜m加矽^yme)是一种专性侵染紫菜并引起紫菜赤腐

2、病的病原菌。为了深入了解紫菜腐霉的遗传信息，本文计划对其开展全基因组测序，而制备高质量的DNA样品是关键性工作。海洋生物生境和代谢的特殊性，细胞中富含的一些次级代谢物质往往影响着DNA样品的质量。紫菜腐霉的基因组DNA样品中具有严重的RNA污染，即使通过延长RNaseA降解时间和增加降解次数也不能完全消除其中的RNA，无法获得满足于PacBio文库构建和测序的DNA样品。本研究首先通过琼脂糖凝胶电泳(AgarosegelelectrOphoresis，AGE)来区分DNA和RNA，然后将DNA条带所在的胶块切下并放入透析袋中继续电泳，使DNA从胶条中迁移到透析袋内的缓冲液中，

3、从而获得DNA的TAE溶液。然后通过透析的方法去除DNA的TAE溶液中的乙酸钠，最终获得DNA的TE溶液。经AGE检测发现DNA条带清晰、无RNA污染；经脉冲场凝胶电泳(Pulsedfieldgelelectmphoresis，PFGD检测发现DNA完整性较好，可用于PacBio文库的构建和测序。关键词：紫菜腐霉；基因组DNA；RNA污染；透析中图法分类号：Q556．2文献标志码：A文章编号：1672—5174(2017)11一047一06DOI：10．16441／j．cnki．hdxb．20160302引用格式：邹丹丹，唐祥海，莫照兰，等．电洗脱法和透析在紫菜腐霉PacBi

4、o全基因组测序DNA样品纯化中的应用[J]．中国海洋大学学报(自然科学版)，2017，47(11)：47—52．ZOUDan-Dan，TANGXian旷Hai，M0Zhao-Lan，eta1．TheapplicationsofelectroelutionanddialysistopurifygenomeDNAofPv￡^iz盯n声or声^vmP[J1．PeriodicalofOceanUniversityofChina，2017，47(11)：47—52．紫菜是一种重要的经济海藻。随着紫菜栽培技术的发展，栽培面积的不断扩大，紫菜病害频发，其中紫菜赤腐病(theredrotdi

5、sease)是最严重影响紫菜产量和品质的病害之一[1]。而且是目前紫菜病害中唯一的一个病原明确且由单一物种引起的病害[2]，引起紫菜赤腐病的病原菌是紫菜腐霉(P．加印矗ymP)，它隶属于卵菌纲(Oomycota)、霜霉目(Peronosporates)、腐霉科(Pythiaeeae)、腐霉属(Py砌i“m)[3

6、。由于人们对紫菜腐霉遗传背景了解较少，赤腐病发病诱因不明，缺乏快速检测病情的手段，也没有高效的抑病、治病手段和方法。传统的紫菜病害控制方法仅在感病初期具有一定的控制效果[4]，因此通过全基因组测序的方法来深入了解紫菜腐霉的遗传信息，从而为开发赤腐病的防治策略打下基础。

7、全基因测序在经过第一代和第二代测序的强势发展后，第三代测序技术开始登上测序舞台并受到广大研究者的青睐。目前的三代测序平台主要有PacificBiosciences(PacBio)公司的单分子实时(Sin91e—mole—culerealtime，SMRT)测序技术、OxfordNanopore公司的单分子纳米孔测序技术(Thesingle-m01eculenan—oporeDNAsequencing)以及Helicos公司的真正单分子测序技术(Truesin91e—m01eculesequencing，tSMSTM)，他们的共同特征就是基于单分子水平的边合成边测序。目前只有P

8、acBio公司的实时单分子测序技术已经商业化，其原理为当正在合成的碱基与某个dNTP一致时，聚合酶紧紧捕获具有特异荧光标记的dNTP，这时激发光从ZMw(零模波导孔)的底部射出，被捕获的dNTP就会发射荧光，仪器根据所拍到荧光的波长与峰值判断该碱基类型[5]。SMRT测序技术最*基金项目：国家自然科学基金项目(31372517)；国家高技术研究计划项目(2012AAloA406)；山东省自主创新专项(2013CXC80202)资助SupportedbyNatiomlNaturalScienceFound