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1、实验一全基因组DNA的分离及纯化由于分离线粒休DNA繁琐、耗时、成本相对较高，目前很多研究采用先分的全基因组DNA,再用特异的引物扩增线粒体基因组的方法，因此获得高纯度全基因组DNA显得尤为重要。现在有很多的商品化试剂盒可以快速高效的从血液，组织中提取基因组DNA,简便快捷，DNA的得率和纯度都很高。我们就TaKaRaDNA提取试剂盒为例，介绍外周静脉血全基因组DNA提取的操作流程。目的：掌握试剂盒提取外周血细胞基因组DNA的方法。原理：本试剂盒是用于动物组织、植物材料、全血和培养细胞（Animaltissues/Plants/Blood/Culturedcells）等全基因组DNA
2、的广谱型小量纯化试剂盒。该试剂盒采用独特的细胞裂解系统，由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA,然后使用特殊的相分离法除去蛋白质、多糖以及脂质等杂质，再结合DNA制备膜技术纯化基因组DNA。本试剂盒具有高效、快速、方使之特点，全套操作约需1小时便可完成。使用本试剂盒町从1〜100mg的动物组织、10〜200mg的植物材料、10〜200皿的全血（含抗凝剂）、10〉〜亦的培养细胞中纯化得到多至数十微克的髙纯度基因组DNA。此基因纟RDNA可用于PCR反应、Southern杂交以及RAPD、AFLP、RFLP等多种分子生物学实验。试剂：该DNA提収试剂盒包括：试剂Set（表4・1）和Colu
3、mnSet（表4・2）。表4・1DNA提取试剂盒试剂试剂Set试剂名称体积RNaseAl(50mg/ml)*165glSolutionA*245mlSolutionB*224mlSolutionC原液*31」mlDBBuffer24mlRinseA28mlRinseB*424mlElutionBuffer12ml注：*1RNaseA1为混浊溶液，使用吋请混匀后使用。*2若出现沉淀，请于65°C加热溶解，待恢复至室温厉使用。*3首次使用前，请将1・1ml的SolutionC原液移入125ml的SolutionC空瓶中，然后加入68.75ml的异丙醇、41.25ml的异丁醇，混合均匀，配
4、制成SolutionC溶液后使用。SolutionC溶液请于4°C保存。*4首次使用前，请添加56ml的100%乙醇，混合均匀。表4・2DNA提取试剂盒ColumnSet试管名称数量FilterCup50支SpinColumn50支CollectionTube(2ml)150支操作步骤：1）①取10〜250卩1的全血（含抗凝剂）加入至CollectionTube中。②加入500（il的SolutionA。③加入1pl的RNaseA1（使用时请混匀），激烈振荡15秒后，冰浴5分钟。2）加入400（11的SolutionB,振荡混合。3）加入1m啲4°C预冷的SolutionC溶液，充分
5、混匀后，12,000rpm离心3分钟。注）SolutionC溶液的制备方法请见笫一页中的说明。4）弃去上层有机相，再加入1ml的4°C预冷的SolutionC溶液，充分混匀后12,000rpm离心3分钟。5）弃去上层冇机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于CollectionTube上的FilterCup中,12,000rpm离心1分钟。6）弃FilterCup,在滤液中加入400川的DBBuffer,混合均匀。7）将试剂盒屮的SpinColumn安置丁-CollectionTube上。将上述操作6混合溶液转移至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。8）将
6、500（11的RinseA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。9）将700卩1的RinseB加入至SpinColumn111，12,000rpm离心1分钟,弃滤液。10）重复操作步骤9。11）将SpinColumn安置于CollectionTube上,12,000rpm离心1分钟。12）将SpinColumn安置丁噺的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜中央处加入50〜200（J的灭菌蒸饰水或ElutionBuffer,室温静置1分钟。13）12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。加SolutionA.RNaseA1加SolutionB振蕩加
7、SolutionC下廛（水相）移至FilterCupVZ弃FilterCup向ig液中加入DBBuffer溶液移至SpinColumn相分离（上层显色.下屋透明）SpinColumn移至1・5mlTube加ElutionBuffer基因组DNA«液弃逹液鳥沪洗SE心呗n图4・1试剂盒提取全基因组DNA操作流程图利用该试剂盒可以从200卩1的外周血中提取1.0昭左右较高纯度的全因组DNA（包括核基因组DNA和线粒体基因组DNA）0相对来说，采用试剂盒提取全基
