猪肝基因组DNA分离纯化及鉴定

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1、猪肝基因组DNA的分离纯化及鉴定摘要利用十二烷基硫酸钠（SDS）裂解猪肝组织细胞，用氯仿、异戊醇抽提蛋白质以分离核酸，然后用盐溶法分离出DNA，用冷乙醇沉淀，最后分别用紫外分光光度法和二苯胺显色法测定DNA纯度，并比较二者的结果。关键词：DNA纯化鉴定紫外分光光度法二苯胺Separation,purificationandidentificationofgenomicDNAinporklivercellsAbstract:Inourexperimentthelysisofporklivercellsis

2、accomplishedwithsodiumdodecylsulfate(SDS).Andtheproteinisseparatedwithchloroformandisoamylalcoholandthenucleicacidisobtained.ThenDNAisseparatedbyconcentrationofNaCl.Finallytheultravioletspectrophotometryisusedtodeterminethepurity.Keywords:DNA;Purificatio

3、n;Determination;ultravioletspectrophotomentry;Diphenylamine核酸研究的首要方法是分离和测定。核酸制备中需要注意的共同问题是防止核酸的降解和变性，要尽量保持其在生物体内的天然状态。故必须采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用。天然核酸都具有生物活性，这是检验其质量的重要指标。物理化学指标也常用来评定核酸的品质，这些指标包括：相对分子质量，紫外吸收，沉降系数，电泳迁移率，粘度等。制备方法的不同因材料的不同而有很大差

4、异1。本实验用新鲜猪肝为材料，用盐溶法提取、冷乙醇纯化（沉淀）DNA，并用紫外分光光度法测定其纯度，获得了较好的效果。1材料与方法1.1实验材料1.1.1溶液与试剂新鲜猪肝4g；SC缓冲液：2.94g柠檬酸钠和9.0g氯化钠溶于1L蒸馏水，并用盐酸调至pH=7.0；5%SDS溶液；95%冷乙醇（于冰箱中冷藏后使用）；氯仿；异戊醇；DNA标准溶液；二苯胺试剂：1g结晶二苯胺溶于100mL分析纯冰醋酸中，加10mL60%过氯酸，混匀，临用前加1mL1.6%乙醛溶液。1.1.2实验仪器冷冻离心机；烧杯；量筒；

5、玻璃棒；三角烧瓶；离心管；紫外分光光度计。1.2DNA的提取1.2.1实验原理根据RNA与DNA在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离：在0.14M的1氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解度大，而DNA核蛋白溶解度小；相反在1M的氯化钠溶液中，DNA核蛋白的溶解度大，而RNA核蛋白的溶解度小，从而使DNA和RNA核蛋白分开。然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离DNA和RNA的目的。1.2.2实验步骤①取新鲜猪肝4g，用SC溶液洗血，剪碎后加入8m

6、LSC溶液掏碎，装入离心管，4000rpm离心10min；②弃去上清液，下层加入5mlSC溶液混匀，同上离心；③弃去上清液，下层沉淀转入三角瓶，加入20mlSC溶液，3mLSDS溶液混匀，加15mL氯仿/异戊醇混匀，然后边加1.2g固体氯化钠边混，充分振荡30min；④4000rpm离心20min后，小心取出离心管，观察到有三层，取上层水相；⑤加入等体积氯仿/异戊醇，振荡10min后4000rpm离心20min；⑥取上清液，加等体积95%冷乙醇，边加边用玻璃棒沿一个方向搅拌，玻璃棒上会缠绕DNA，用少量

7、无水乙醇洗一次，沥干，加1mLSC溶液溶解后放入小离心管，于4℃冰箱待用。1.3DNA含量测定（紫外分光光度法）1.3.1实验原理核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，而由于各组分结构上的差异，其紫外吸收有一定的区别。通常选用260nm的紫外波长来测定核酸或核苷酸。浓度为1μg/mlDNA的天然DNA水溶液在260nm处的吸光度为0.020，也就是说在测得A260=1时，DNA的浓度c=50μg/ml；而RNA测得A260=1时，RNA的浓度c=40μg/ml。核酸的纯度可以通过测A2

8、60/A280来确定：纯DNA的A260/A280=1.8；纯RNA的A260/A280=2.0。如果DNA的A260/A280小于1.8，说明有蛋白质污染；如果DNA的A260/A280大于1.8，说明有RNA污染。1.3.2实验步骤①1mlSC溶液溶解DNA，8000rpm离心5分钟后，将上清转移到5ml离心管中，用1ml0.01MNaOH溶液加入沉淀中，使其充分溶解，并再次离心5分钟，上清与第一次溶解液合并备用；②A260测定：以SC