细胞传代培养(消化法).doc

《细胞传代培养(消化法).doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、来源：亓传徳的日志细胞传代培养（消化法）具体操作：一.传代前准备：1•预热培养用液：把己经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37°C水浴锅内预热。准备离心管，吸管，紫外线30min消毒超净工作台。2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。3•正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而冃可减少污染。4•点燃酒精灯：注意火焰不能太小。5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。6•取出预热好的培养用液：取出己经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微

2、镜的台面，再在镜下观察细胞。8.打开瓶口：将备瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。二•胰蛋白酶消化；1.加入消化液：小心吸出I口培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适景消化液（胰蛋白酶液），注愆消化液的量以盖住细胞最好，在37°C培养箱消化2min。2显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质冋缩，细胞Z问不再连接成片，表明此时细胞消化适度。3.加入培养液：更换吸管，加入新鲜的培养液。4.吹打：用吸管将己经消化细胞吹打成细胞悬液三•离心分散细胞：1•吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管屮。2•平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机屮，以1000转/分钟离心3・5分钟。3

3、•弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用吸管轻轻吹打细胞80下制成细胞悬液。四•分装稀释细胞:1・分装：将细胞悬液吸出分装^2-3个培养瓶中，加入适杲培养基旋紧瓶盖。2•显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5x105/mL最后要做好标记。说•继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入C02培养箱屮继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为•个+，占50%为++,占75%时为+++。传代细胞培养注意事项：1.严格的无菌操作2.适度消化：消化的时间受消

4、化液的种类、配制时间