细胞消化传代培养.doc

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1、标准操作规程题目:细胞消化传代培养目的通过胰酶消化的方法使细胞尽可能单一，再根据需要分离培养，为其他细胞生物学实验做准备。规程内容1．实验准备:1.1材料：移液器（P1mL，P200，P20，P10，P2，Gilson）吸头（10μL，100μL，1000μL，Axygen）6cm、10cm培养皿（corning）EP管（1.5mL）废液缸75％酒精棉球酒精灯1.2试剂：培养基(RPMI1640,Invitrogen或DMEM,Invitrogen)胎牛血清(四季青)0.25％胰蛋白酶PBS液1.3仪器：CO2培养箱（MCO-18AICSANYO）5/5倒置显微镜（DM

2、I3000BLeica）超净台（MSC1.8Thermo）离心机（TDL-5C安亭）1．操作步骤：以6cm培养皿为例说明，待细胞长至90%左右密度传代。2.1将培养皿盖子半打开，用手拿住培养皿，使培养皿倾斜30度左右，移液器吸去培养基上清（见附图D）；弃去枪头于废液缸中；2.2单手拧开该PBS50mL离心管，移液器吸取PBS液1mL。拧上PBS管盖，右手持1mL移液器，移液器与操作台成45度左右，枪头靠近培养皿壁（见附图A），沿壁缓慢加入1mLPBS液，盖上培养皿盖子，左手轻轻晃动培养皿，使PBS液完全覆盖细胞，洗一遍，弃去上清，重复该步骤一次。单手拧开该胰酶50mL离

3、心管，移液器吸取胰酶液1mL。拧上胰酶管盖，右手持1mL移液器，移液器与操作台成45度左右，枪头靠近培养皿壁（见附图A），沿壁缓慢加入1mL胰酶液，盖上培养皿盖子，左手轻轻晃动培养皿，使胰酶液完全覆盖细胞，右手用1mL移液器从皿中吸取胰酶，留下胰酶150μL左右，盖上培养皿。放入培养箱中消化；2.3消化2.3.1消化1~3min（根据细胞消化难易程度决定时间），待细胞在镜下变圆、拍打培养皿边缘细胞能够出现裂纹，细胞呈细沙状滑落时，终止消化。半打开培养皿，左手拿起存放完全培养基的50mL离心管，单手拧开，右手用1mL移液器吸取1mL培养基，单手拧上培养基管盖。右手将培养基

4、1mL完全加入到培养皿，终止消化。左手拿起半开的培养皿，倾斜45度，用1mL移液器上下来回吹打培养皿底部（见附图C），至细胞完全脱落。再继续吹打数下，转移至1.5mL标记好的离心管中；2.3.2消化3~5min（根据细胞消化难易程度决定时间），待细胞在镜下变圆、拍打培养皿边缘细胞能够出现裂纹，细胞呈细沙状滑落时，半打开培养皿，左手拿起存放完全培养基的50mL离心管，单手拧开，右手用1mL移液器吸取1mL5/5培养基，单手拧上培养基管盖。右手将培养基1mL完全加入到培养皿，终止消化。左手拿起半开的培养皿，倾斜45度，用1mL移液器上下来回吹打培养皿底部（见附图C），至细胞

5、完全脱落。再继续吹打数下，转移至1.5mL标记好的离心管中；2.1.1消化5~15min（根据细胞消化难易程度决定时间），待细胞在镜下变圆、拍打培养皿边缘细胞能够出现裂纹，部分难吹的细胞需呈细沙装滑落，半打开培养皿，左手那培养基，单手拧开，右手拿枪头，吸取1mL培养基，单手拧上培养基盖。右手将培养基1mL完全加入到培养皿，终止消化。左手拿起半开的培养皿，倾斜45度，用1mL移液器上下来回吹打培养皿底部，至细胞完全脱落。吹打数下，转移至1.5mL标记好的EP管中；2.1.21300rpm离心3min；2.1.3离心等待的过程中，用1mLPBS缓冲液吹洗吸去培养基的培养皿一

6、遍，洗去培养皿中残留细胞，在培养皿中加入5mL完全培养基；2.1.4在培养皿盖上标记好：传代代数，传代比例，日期，如Pn（1：m）20100908，n表示传代代数，1：m传代比例2.1.5离心完毕后，尽量完全吸去离心上清，从培养皿中吸取1mL培养基重悬离心管中的细胞，用移液器吹匀；2.1.6取100μL细胞悬液（即1：10传代）于培养皿中，于培养箱前摇匀，立即放入培养箱中，37℃，5%CO2条件下培养，在细胞贴壁前避免移动培养皿；2.2撰写详细的实验记录。5/5附图基本操作：A:加入胰酶B:加入培养基C:吹打细胞D:吸出液体1．注意事项3.1当手或其他东西要经过培养皿时

7、，应先将培养皿先盖好。2．经验总结4.1较易消化的细胞有：H1299、T24、Hep3B、95D、293T等；4.2不易消化的细胞有：HepG2、SMMC7721等绝大多数库中细胞；4.3极难消化的细胞有：5637、CFPAC-1和ASPC-1；4.4注意力度，尽量用小力，因为物理剪切力对细胞的损伤是不可逆的；4.5根据细胞生长速度决定传代比例；4.6在细胞长到80%~90%时，必须传代。如果等到100%满了或者培液黄了，这时的细胞状态已经不好，会影响到以后的实验；5/54.7在加胰酶消化的时间不能长，当细胞变圆可以拍打下来的时候，立即加