实验二_细胞传代培养

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1、实验二细胞传代培养姓名：程辉辉学号：2014308110001【实验内容】CIK细胞及L8824细胞的传代培养【材料准备】药品：NaCl,KC1,Na2HPO4.12H2O,KH2PO4,胰蛋白陋，EDTA,hepes,碳酸氢钠，培养基，胎牛血清（四季青）,GPS；器具：容量瓶，三蒸水，蒸僻水瓶，烧杯，天平，药匙，称量纸，玻璃棒，一次性滤器，一次性注射器，银子，酒精灯，打火机，医用洒精，洒精喷壶，消毒纱布，标签纸，废弃缸，记号笔，橡胶手套；仪器：生化培养箱，倒置显微镜，超净台，加液枪，台式离心机；试剂瓶：1

2、00mL24个，需灭菌备用。【实验步骤】工作前打开紫外灯，消壽30分钟；带手套，用75%的酒精擦拭消毒双手；超净台面用酒精喷洒，再用消壽纱布擦净。•观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞氏满瓶底，确定细胞是否盂要传代；•上超净台：将试剂瓶、移液管盒、离心管、培养瓶等培养用具用酒精擦试消毒，合理摆放,便于使用；•开盖：旋开培养瓶盖，瓶盖放在酒精灯旁的台面上（瓶盖不能倒扣放置），将培养瓶中的液体（山培养基）倒入15mL离心管备用，培养瓶口和瓶盖过酒精灯火焰后加盖；•清洗死细胞：打开装移液管的盒子，用手捏住移

3、液管（5mL）尾部从盒子中拖出（注意不要将管壁和管口碰到英他物品上），在移液管后端安上加液枪，过酒精灯火焰略烧管口和悸壁以及手碰到的地方，酌情吸2-3mLPBS-EDTA液，轻轻涮洗残留的1口培养基以及漂浮的死细胞，倒掉涮洗的残液；•胰酶消化：用移液管（再过一次火焰），吸取2mL胰酶，加入培养瓶内，盖好瓶盖后，在倒宜显微镜下观察，当80%的细胞收回突起变圆时，立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶；•小和消化：轻轻扌门击细胞培养瓶，使细胞脱离细胞瓶，用移液管吸取III培养基上清液3mL,加入瓶中终止细胞消化，并反复

4、轻轻吹打；•沉淀细胞：将细胞悬液吸入另一个15mL的离心管中，旋转盖紧，1000转/分钟离心7-8分钟；•加新液：离心后倒掉上清液，保留细胞沉淀（注意只能倒一次，不能反复倒），取一根新移液管，吸取8mL的新鲜培养基加入培养瓶屮4mL,另外4mL加入离心管吹打细胞沉淀使细胞悬浮，再加入培养瓶屮，与Z前的4mL培养基混匀；•接种：将上述8mL细胞悬液吸取4mL到另一个新瓶中，接种后2个培养瓶中的悬液各4mL；培养：盖上瓶盖，拧紧,做好标记，放入生化培养箱静置培养。如果放入CO2培养箱，需将瓶盖拧紧后再稍回转,以

5、利于CO?气休的进入;每犬观察细胞牛长状况,适时进行再次传代。【结果分析】2015.4.20EPC—代细胞2015.4.22EPC~代细胞EPC—代细胞长势良好，但传到第二代吋，由于细胞培养箱控温系统出现故障，导致培养箱温度过高，细胞化长界常,慢慢岀现细胞凋亡和死亡。【注意事项】1.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。如发现细菌有污染迹象，应立即采収措施，一般应弃置污染的细胞。2.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近洒

6、梢灯火焰。手不能在瓶口上方操作，以免污染气体进入瓶内。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。每种试剂各用一个移液管。培养用液应严格分开。3.细胞消化时耍注意观察，不要消化过度。吹打细胞时，确保瓶壁所有地方均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要川力过大，以防细胞破碎。4.培养箱不要反复多次开关，以免影响稳定的温度，降低污染的机率。