实验三 细胞的传代培养与冻存.ppt

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1、实验三细胞的传代培养及冻存实验目的1.掌握细胞传代培养的方法2.掌握细胞冻存的方法3.建立严格的无菌操作观念实验原理传代培养是组织培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行。实验原理利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验，起到了细胞保种的作用。还可以利用细

2、胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%-15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。低温保护剂细胞直接冻存会导致细胞死亡。必须加低温保护剂。常用：二甲亚砜（DMSO）。是一种渗透性保护剂。机理：可迅速透入性别，降低冰

3、点，提高细胞膜对水的通透性，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，提高细胞内的电解质浓度，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞冻伤。浓度：5~10%，细胞冻存1~2年，存活率80~90%。二甲亚砜有一定的毒副作用，能引起蛋白质变性。解冻后，细胞出现凝集现象。用于病人可出现心律失常、高血压等症状。目前，造血干细胞冻存时，采用5％DMSO+6%HES（羟乙基淀粉）两种冷冻保护剂。实验材料癌细胞；10%胎牛血清和DMEM培养液；消化液（0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液）；D-Ha

4、nk’s液；冻存液细胞培养皿；离心管；冻存管；微量移液器75％酒精棉球；酒精灯1台；废液缸液氮；二氧化碳显微镜；细胞培养箱NCI-H460SPCA1KYSE30KYSE510操作步骤弃去细胞瓶中的原有培养液。加入适量D-Hank’s液(1mL)，轻轻摇动，洗去老化的细胞及残留的培养液。重复两次。加入适量消化液(1mL)，轻轻摇晃至平铺细胞瓶底层，37℃静置2min，直至细胞层发白、卷边、有间隙，即将脱落，加入3mL营养液终止消化。用吸管反复均匀吹打瓶壁，使细胞脱落，并形成单个细胞状态向细胞沉淀中再加入6m

5、l的营养液制成细胞悬液，分别加入新的细胞培养瓶中（5mL/瓶），拧好瓶盖，放入培养箱中。37℃培养24h后观察结果。操作步骤弃去细胞瓶中的原有培养液。加入适量D-Hank’s液(1mL)，轻轻摇动，洗去老化的细胞及残留的培养液。重复两次。加入适量消化液(1mL)，轻轻摇晃至平铺细胞瓶底层，37℃静置2min，直至细胞层发白、卷边、有间隙，即将脱落，加入3mL营养液终止消化。用吸管反复均匀吹打瓶壁，使细胞脱落，并形成单个细胞状态。转移到离心管中，1500r/min,离心5min。弃去上清，细胞沉淀中再加入0

6、.9ml的营养液制成细胞悬液，转移入冻存管，再向冻存管中加入0.9ml冻存液,拧好瓶盖，放入4℃冰箱中1h,-20℃冰箱中1h,-80℃冰箱中过夜，转移至液氮中。实验结果1、观察细胞形态2、注意是否污染3、冻存细胞注意事项操作前要洗手，进入超净台后手用75%的酒精擦拭。试剂等瓶口也要擦拭或灼烧。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。吸过营养液的用具不能再灼烧，以免烧焦形成碳膜。不能用手接触已消毒器皿的工作部分。吸溶液的吸管不能混用。传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。每次最好只进行一种细胞的操作。每

7、一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，平铺细胞瓶底层，生长致密时即可继续传代。实验报告实验三、细胞的传代培养及冻存一、实验目的二、实验原理三、实验材料四、实验步骤（可用自己的话总结简述）五、实验结果细胞拍照图片六、思考题：1、为什么细胞冻存复苏要缓慢冻存，快速复苏?