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1、COS7细胞冻存和复苏传代培养郭美琼指导老师陆家海欧阳丽萍研究目的建立CoS-7细胞培养的方法观察COS－7细胞培养的特点了解COS－7细胞的用途建立CoS-7细胞培养的方法主要阐述CoS-7细胞培养的体系观察COS－7细胞培养的特点是贴壁细胞还是悬浮细胞？细胞培养过程中形态的变化，分裂生长的形式等了解COS－7细胞的用途COS-7细胞的来源、特性及生命医学用途：小结COS7细胞(猴细胞的一种细胞系)为重组病毒的宿主细胞，是表达SV40大T抗原的非洲绿猴肾细胞株，能支持部分突变型SV40和含SV40ori的质粒载体的复制,可高水平表达外源基因，常
2、作为瞬时表达宿主。故本实验建立COS7细胞的冻存和复苏传代方法。（一）实验材料1细胞株cos7细胞株2试剂RPMI-1640培养基‚小牛血清（NBS）‚N-(2-羟乙基)-哌嗪-Ng-2（丙磺顺酸）（Hepes，Sigma公司产品）胰蛋白酶‚碳酸氢钠以及链霉素和青霉素3实验准备1培养液的配置1(1)RPMI-1640液：1640粉2袋‚Hepes2.14g‚碳酸氢钠4.0g加水至2000ml调至PH=7.15，过滤。1(2)1640完全培养液：10％小牛血清＋双抗（含链霉素、青霉素）的1640培养液，4℃保存。1(3)10%DMSO冻存液的配置：
3、1份DMSO‚3份小牛血清‚6份完全培养基1(4)胰蛋白酶1.25g‚EDTA（乙二胺四乙酸二钠）0.10g‚于烧杯中先用少许PBS调成糊状，再补充PBS至500ml，搅拌混匀4小时后用滤器过滤除菌，分装，低温保存。2Cos7细胞冻存方法2（1）取对数生长期的细胞，收集细胞前换液一次。2（2）Cos7细胞培养物经胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，1200转/分离心1分钟，去上清。弹指法分散沉淀细胞后，左手摇动离心管，右手逐滴加入与细胞悬液等量的DMSO冻存液。2（3）分装：细胞悬液分装在2ml冷冻管中，密封后标记细胞名称和冷冻日期。2（4）梯度降温冻存
4、：冷冻管置-20℃、停留1～2小时，再降至－70℃过夜，投入液氮。3Cos7细胞复苏3（1）将加有小牛血清＋双抗的1640完全培养液从冰箱取出，升至室温。3（2）从液氮中取出冻存管，迅速投入3738℃水浴中，摇晃使其在1分钟左右融化。3（3）转至EP管，加1640完全培养液至1.5ml左右，吹打，1200转/min，离心3分钟。3（4）去上清，再加1640完全培养液至1.5ml左右漂洗，离心3分钟。去上清，加新鲜培养液吹打重悬浮细胞，转至培养瓶中加培养液至总体积约4ml.，置温箱培养。4Cos7细胞传代4（1）弃掉培养瓶内原来的培养液，加入5～7
5、滴，轻轻转动培养瓶，让胰蛋白酶浸匀整个瓶底，吸出胰蛋白酶。4（2）再加入8～10滴0.25%胰蛋白酶，将培养瓶置37℃、5％CO2孵箱2～3min，观察细胞胞体回缩变圆,细胞接近脱离瓶壁时终止消化。4（3）小心吸出并弃去胰酶，加入1～2ml1640完全培养液，用吸管吹打细胞，制成细胞悬液，1∶4传代。各瓶加入培养液2ml，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。二结果1复苏细胞：第1d,镜下观察复苏细胞悬浮于培养液中,折光性强,胞体呈圆形。第2d,复苏细胞镜下观察细胞大部分贴壁。第3d,复苏细胞镜下观察细胞增殖速度较快，折光性好。5d后可按比例传代
6、。2传代细胞：第1d,镜下观察传代细胞悬浮于培养液中,折光性强,胞体呈圆形。第2d,中,传代细胞镜下观察细胞已贴壁,折光性好,少数细胞出现伪足。第3d,传代细胞培养液镜下观察大部分细胞已伸出伪足,细胞轮廓清楚,折光性强,细胞数量明显增多。3传代细胞传至第6～8代仍保持增殖状态，细胞生长速度未见减慢,能长满瓶底。三讨论1养细胞维持传代以供实验用常遇到某些困难。首先，细胞株在传代中其性质发生变化。其次，在传代中有微生物污染的危险。解决这些困难的办法就是将细胞冻存。细胞冻存在液氮中，贮存时间几乎是无限的（因为在-130℃以下，所有的生化反应已停止，而液
7、氮的温度在-150～-160℃之间）2培养细胞在瓶壁汇合后，需进行分离再培养，否则正常细胞因生存空间不足或细胞密度过大，导致营养不良而引起细胞衰老¸停止生长¸甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行稀释再培养，即将培养瓶内的细胞分离¸稀释¸接种到新培养瓶内继续扩大培养。首次传代的细胞接种数量要多些，使细胞尽快适应新环境，以利于细胞的生存和增殖，通常原代细胞按1：2分种传代，细胞株按1：4分种传代3实验需严格遵守无菌操作规则，以减少操作引起的污染。一切操作，都要在火焰周围进行，瓶口、吸管等要经过火焰消毒。但用于吸取细胞培养液、小牛血清、酶液的吸
8、管使用后不能在火焰上消毒，因为残留在吸管中的培养液烧焦炭化，再使用时会把有害炭化物带入培养液中毒害细胞。4实验完毕，关闭超净台鼓风机和电
