细胞实验细胞冻存

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1、细胞生物学实验细胞冻存一、实验目的1.理解细胞冻存的原理2.熟悉细胞冻存的方法与过程3.熟悉无菌操作技术二、实验原理细胞冻存是细胞保藏的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196C的液氮小长期低温保存，可以使细胞暂时脱离牛长状态并将其细胞特性保存起來，在需要的吋候再复苏细胞用于实验。而且适时适量的保存细胞可以防止因正在培养的细胞被污染或者其他意外的事件而使得细胞种丢失，达到细胞保种的FI的。此外，还可以利川细胞的冻存形式來购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存需在培养基中加入保护剂——终浓度5%〜

2、15%的甘汕或二甲基亚矶(DMSO),保护剂可以使溶液的冰点降低，减少了山于在缓慢降温冻结的条件下细胞内水分的渗出，减少了冰晶的形成，从而避免了细胞的损伤。细胞采川“慢冻速融”的方法能较好地保证细胞的存活率。标准冷冻的速度为・1〜・2°C/min,当温度低于・25°C时可加速冷冻，到・80°C时可直接加入液氮屮(・196°C)。复苏细胞时则直接浆细胞冻存管放到37〜40°C热水小迅速解冻。三、实验步骤1.入无菌室Z前首先要用肥皂洗手，用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是

3、否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37OC下预热。3.超净台台iHi应整洁，川75%酒精擦双手消毒。4.关闭已照射超净台台面20分钟左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。5.点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士徳吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。6.将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。7.取待冻存的细胞川胰酶消化，靠近火焰倒掉胰酶。8.加入人约2ml冻存液(10%DMSO+20%FCS+70%DMEM)——轻轻吹打细胞沉淀制成细胞

4、悬液。细胞浓度宜大，3（）0万/ml左右。1.细胞悬液装入冻存管中。用胶布封裹，做好标记（写上细胞种类，时间及冻存条件等）。2.冻存管在4°C下存放30分钟，再转入-80°C,4〜12小时后即可转移到液氮内（・196°C）。四、实验结果（冻存的人宫颈癌Hela细胞复苏倒置显微镜20X）五、实验结果分析本次实验的实验结果较好，细胞无污染，冻存的人宫颈^Hela细胞经复苏后，贴壁细胞的的浓度合适，R经过冻存与复苏后，细胞的复苏存活率较高。但是在做实验的过程中,由于没冇相关实验的经验导致侑些手忙脚乱，在配制

5、冻存液的时候将DMSO、FCS、DMEM的浓度加错，因此又重新配制；同吋在实验过程中积累了许多经验与教训。参考文献：细胞牛物学实验（桑建利，谭信）