实验五--细胞的传代培养.doc

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1、实验5细胞的传代培养一、实验目的熟练掌握动物细胞的传代培养法。二、实验原理哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。三、仪器、材料与试剂1仪器CO2培养箱，倒置显微镜，超净台2材料培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。3试剂完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。四、实验步骤1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。2.倒置显微镜下观察

2、细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mLHanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注

3、意勿使细胞提早脱落入消化液。9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。五、注意事项1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。2.每天观察

4、细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。六、实验报告1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？2.细胞传代培养的目的是什么？