Southern Blot原理及实验方法.pdf

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1、SouthernBlot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/LNaCl，0

2、.5mol/LNaOH。中和液：0.5mol/LTris-HCl(pH=7.0)，1.5mol/LNaCl。20×SSC：3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠。以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1.在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。2.将凝

3、胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。3.用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。4.取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。5.把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。6.裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记

4、号，以确定滤膜方位。先把它放在去离子水中润湿后，再放在20倍SSC溶液中润湿5分钟，然后放在凝胶表面，两层之间不可有气泡。7.然后再把两张与滤膜一样大小的二号滤纸，在2倍SSC溶液中浸湿，覆盖在硝酸纤维膜上，同样要把气泡赶走。8.把一叠吸水纸（或卫生纸，约有5—8cm高，略小于滤纸），放置在滤纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和重约500g的重物，放置过夜。9.转移结束后，移去上面的吸水纸和滤纸，同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜，把凝胶的点样与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。11.把已转移了DNA的硝酸纤维膜放

5、在6倍SSC溶液中振荡浸泡5分钟，然后放在滤纸上吸干溶液。再把它夹在两层滤纸之间，80℃真空干燥2小时。注意事项（1）将凝胶中和至中性时，要测pH,防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。(2)要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。SDS-PAGE实验原理及注意事项SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。一、原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶

6、，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺

7、凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE后，就只出现一条蛋白质区带。SDS—PAGE可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH和凝胶孔径等所组成。1．样品的浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓

8、冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly(pI＝6.0，pKa=9.7)只有很少部分解离成Gly的负离子，而酸性