《PCR引物设计》PPT课件.ppt

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1、第六章PCR引物设计及相关软件使用主要内容引物设计原理引物设计的优化原则PrimerPremier5.0介绍举例说明引物的设计引物设计原理引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选。引物设计的原则1、引物长度大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用短的(16～18)的引物；若产物长5kb，则用24个核苷酸的引物。有人用20～23个核苷酸引物得到40kb的产物。引物设计的原则2、引物GC含量GC含量在40%－60%之间，以45-55％为

2、宜。这可为有效退火提供足够热。引物设计的原则3、引物Tm引物所对应模板序列的Tm值最好72℃左右。至少要在55－80℃之间。Tm=2(A+T)+4(C+G)（引物长度在25bp以下）对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm=81.5+16.6xLog10[Na+]+0.41(%GC)–600/size公式中，Size=引物长度。引物设计的原则4、引物3’端引物3’末端和模板的碱基完全配对防止一对引物内的同源性考虑末端5个碱基的ΔG，最好不要富含G/C引物3′端要避开密码子的第3位引物设计的原则5、选择T引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时

3、，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T，避免A。引物设计的原则6、最好在模板cDNA的保守区内设计DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。引物设计的原则7、引物自身及引物之间不应存在互补序列引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

4、引物设计的原则8、碱基要随机分布引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列（不应超过3个连续的G或C），否则容易导致错误引发（Falsepriming）。引物设计的原则9、引物应具有特异性引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。引物设计的原则10、ΔG值ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。引物设计的原则11、引物的5

5、′端引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰，引物5′端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物设计的原则12、在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物PrimerPremier5.0简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0使用介绍PreimerPremier启动界面Loadsequence基本信息SequencenameOrigin

6、alsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及

7、产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But…引物编辑引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1举例说明SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFPSPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR