最新PCR引物设计.ppt

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时间:2020-12-03

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1、一、PCR引物设计原则PCR原理1、引物是否必须是从基因片段起始端开始?PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核酸片段,使其能有效地扩增目的DNA序列__________________________________________________十条PCR引物的设计原则总述①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。(如何避免)③引物长度一般在15~30碱基之间。(太长和太短?)④G+C含量在40%~60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。(引物二聚合体)⑦引物之

2、间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5’端可以修饰。⑨引物3’端不可修饰。⑩引物3’端要避开密码子的第3位。__________________________________________________1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。有时由于模板的复杂性而无法判断,但尽量避免和基因内部有过高的同源性哪些DNA片段可作为模板?GFP在质粒上,和GFP在基因组上?哪个作为模板,更容易得到专一的GFP片段?________________________________

3、__________________2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。__________________________________________________3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer。引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T),Ln值

4、不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性。__________________________________________________4.G+C含量G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。Tm温度过高过低会

5、出现问题__________________________________________________5.碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。__________________________________________________6.引物自身引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断,引物自身

6、连续互补碱基不能大于3bp。__________________________________________________7.引物之间两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。__________________________________________________8.引物的3’端 引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能,引物3′端不能发生错配。_____________________

7、_____________________________9.引物的5′端引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。一般引物要引入酶切位点一般还需要引入保护碱基__________________________________________________10.密码子的简并如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码

8、子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。引物设计还要结合克隆载体的酶切位点阅读框架(尤其是要表达时,参考表达载体)引物上是不是一定要设计加上酶切位点,如果没有酶切位点,如何连接到载体上去?____________________________________________________________

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