PCR引物设计.ppt

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1、PCR引物设计演讲：叶丽娜李昆余恩超潘美慧引物的概念及类型：①引物概念：引物指的是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点。②引物类型：RNA引物——存在于自然界中生物DNA的复制引物。DNA引物——聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物。所有的DNA复制都是从一个固定的起始点开始的。而DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，不能够从头合成DNA。因此体外扩增DNA时要以一小段DNA引物作为复制的起始点。RNA聚合酶能够从头合成RNA，因此自然界中生物DNA的复制以RNA引物作为复制的起始点。引物设计的目的引物设计的目的PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸序列，

2、使其能有效的扩增模板DNA链。下游引物5'—GAACTTT—3'P25'—GGATCTAGCGTAGCTTGAAA—3'正义链3'—CCTAGATCGCATCGAACTTT—5'P15'—GGATCTA—3'上游引物P1：5'-GGATCTA-3'P2：3'-TTTCAAG-5'引物与模板结合示意图PCR原理示意图引物设计基本原则①引物应在核酸序列保守区内设计并具有特异性。②引物长度一般在15—30bp之间，常用18—27bp。③G+C含量在40%—60%之间。上下游引物GC含量不应相差太大，以有利于退火温度的选择。引物Tm=4（G+C）+2（A+T），退火温度一般比设定的引物T

3、m低5℃。④碱基要随机分布。不要有聚嘧啶或聚嘌呤存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C。⑤引物自身不能有连续4个碱基的互补。以免形成发夹结构。尤其要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。⑥引物之间不能有连续4个碱基的互补。尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。⑦△G值（自由能）：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。△G值（绝对值）越大，则双链越稳定。⑧引物3'端不可修饰,因引物的延伸是从3'端开始的。⑨引物5'端可以修饰。引物的其他类型1、通用引物：（1）细菌通用引物：细菌的16srRNA存在于所有细菌的基因组

4、中，且16srRNA具有高度的保守性和特异性。针对16srRNA可设计出鉴定细菌的通用引物。常用的16srRNA通用引物为：27F：5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'1492R：5'TACGGCTACCTTGTTACGACTT3'引物的其他类型（2）测序通用引物：如M13通用引物，以M13噬菌体作为载体，将目的基因连接到载体上，再以M13引物扩增载体，对目的基因进行测序。M13通用引物序列：(5'→3')M13R：CAGGAAACAGCTATGACCM13F：TGTAAAACGACGGCCAGTTwoprimerscomplementarity.Maxcomplem

5、entarityincontinuous:3bp,freeenergy=1.50Kcal/mol5'-CGAGAACTTTACCGCCACG-3'

6、

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8、3'-GACCCGAGGAAGCACTACT-5'Maxcomplementarityindiscontinuous:7bp5'-CGAGAACTTTACCGCCACG-3'

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15、3'-GACCCGAGGAAGCACTACT-5'Twoprimerscomplementarity.Maxcomplementarityincontinuous:5bp,freeenergy=-2.60Kcal/mol5'-TTTTGGGTTT

16、GGACTGTGCC-3'

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21、3'-CACCACGCCAAAACTGAAGT-5'Maxcomplementarityindiscontinuous:10bp5'-TTTTGGGTTTGGACTGTGCC-3'

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31、3'-CACCACGCCAAAACTGAAGT-5'