PCR引物设计.ppt

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1、PCR引物设计PCRprimerexpress聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)体外核酸扩增技术能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。PCR使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值。PCR技术的创建KaryB.Mullis（穆利斯（美））Khorana(1971)

2、等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,扩增DNA的设想。1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。1.PCR的基本原理PCR的原理是根据待测DNA片段两端的核苷酸序列，设计并人工合成两个分别与DNA片段两端互补的寡聚核苷酸引物，在有过量的引物、过量的底物（4种dNTP

3、）、DNA聚合酶以及模板的反应体系中，经过高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段的循环周期，对DNA分子进行扩增。由于新合成的DNA双链能够作为下一循环的模板，所以模板DNA以几何级扩增。一般经过30-35次扩增循环，可使目的基因DNA片段放大数百万倍。2.PCR体系的主要成分①模板DNA（靶基因）②特异引物③底物dNTP④耐热性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）⑤Mg2+缓冲液1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃

4、下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶，特别是染色体中的组蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（2）引物浓度0.1-0.5mol

5、/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l酶量过高可引起反应非特异性扩增;酶量过少则合成产物量减少。（4）dNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等，如果有一种浓度不同于其他几种，就会引起错配。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+浓度Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2

6、.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高反应特异性降低，出现非特异扩增。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。threesteps:Denaturation(变性):将反应体系加热至90-97℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除。Annealing(退火):当温度突然降低至45-65℃,引物与其互补的单链DNA模板在局部形成杂交链。Extension(延伸):将温度升高至70-7

7、4℃下，在TaqDNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下引物沿着模板DNA延伸。利用PCR仪来控制温度3.HowPCRworks聚合酶链式反应1.Denaturation2.Annealing3.Extension以上三个步骤构成一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30）次即可达到扩增DNA片段的目的。5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA555555555EssentialComponen

8、tsofPCRReactionsalts(ions)dNTPsPrimersDNAPolymeraseTemplateDNAPCR动画4.引物设计原则引物设计是PCR技术中至关重要的一环，其优劣直接关系到PCR的特异性和实验能否成功。①引物要与模板