高效液相色谱法测定牛奶中的四环素类抗生素残留.docx

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1、实验六高效液相色谱法测定牛奶中的四环素类抗生素残留姓名：班级：食品科学学号：一目的要求1通过实验强化对高效液相色谱法分离及定量分析原理的理解；2直观了解流动相组成在高效液相色谱中对分析物保留时间和分离度的影响；3直观了解高效液相色谱仪的结构；4掌握利用外标法进行定量分析的方法。二实验原理在畜牧生产过程中，将一些抗菌素作为添加剂以较低浓度加入到饲料中，可使导致动物生产效率下降的支原体病等慢性传染病得到有效抑制，因而能够促进动物生长。但是，这种做法常导致在动物性食品中的抗生素残留，人类食用后导致耐药菌群的产生，将会产生一系列严重后

2、果。四环素类抗生素就是被经常使用的一类抗生素，其中四环素（Tetracycline,TC）、土霉素（Oxytetracycline,OTC）和金霉素（Chlortetracycline,CTC）就是该类抗生素中的三种，是提取自链霉菌属培养液的广谱抗生素，结构如下：我国和欧盟规定其在牛奶中的最大残留限量为0.1mg/kg。三种抗生素在酸性条件下稳定，易与蛋白质发生强烈结合，且易与金属离子形成鳌合物。在乙二胺四乙酸二钠（EDTA）存在条件下，用草酸甲醇提取可获得较高回收率。三种抗生素的共有结构均可在C18柱上产生保留，OTC和

3、CTC均与TC仅差一个取代基，采用适当的流动相，以反相色谱方式可将三者有效分离。三者具有共同的发色团，在225、268和360nm均有吸收，短波吸收易受干扰，采用360nm作为吸收检测波长可获得较好的同时测定结果。采用外标法对样品中三种抗生素进行定量分析。对标准溶液系列分别进行高效液相色谱分离，测定三者各自的峰面积，并以此回归三者的工作曲线，样品分离后通过测定三者各自峰面积，可在各自工作曲线上计算出浓度。三仪器与试剂1仪器LC-20AT型高效液相色谱仪，配备SPD-20A型紫外检测器（日本Shimadzu公司）；B5500S-

4、MT型超声清洗器（上海必能信超声有限公司）；L500台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；BS124S电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）。2试剂甲醇、乙腈、草酸、EDTA均为分析纯试剂，TC、OTC和CTC标准品（德国Ehrenstorfer公司）含量98%。四实验步骤1试剂配制草酸水溶液：称取1.26g草酸，用水溶解并定容于1000mL，浓度为0.01mol/L。草酸甲醇溶液：称取1.26g草酸，用甲醇溶解并定容于1000mL，浓度为0.01mol/L。TC、OTC、CTC标准储备液：分别称取TC、OTC、CT

5、C各1mg，用甲醇溶解并定容于10mL，浓度均为100mg/L，储存于-18℃冰箱中。2标准溶液系列和样品制备标准溶液制备：吸取适量标准储备液，用流动相逐级稀释，制成三者浓度均为0.05、0.10、0.25、0.50、1.0、2.0mg/L的标准溶液系列，此标准系列储存于4℃冰箱可保存3d。样品制备：准确称取牛奶样品5g，置于50mL离心管中，加入5mL0.01mol/L的草酸甲醇溶液、0.1gEDTA，旋涡混合3min，超声振荡3min，以10000r/min离心10min，取出全部上清液并量出体积（或用流动相稀至最近整数体

6、积），过0.45μm滤膜后供测定。3测定色谱柱为Nova-PakC18柱，填料粒径4μm，柱尺寸300mm×3.9mm；流动相为乙腈＋甲醇＋0.01mol/L草酸水溶液（22＋8＋70）；流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长360nm，带宽20nm，参比波长430nm，带宽50nm；进样量25μL。升高流动相中乙腈比例至35，降低水比例至57，观察在高效液相色谱中流动相组成的改变对分析物保留时间和TC、OTC、CTC之间分离度的影响。4实验结束后，按要求关好仪器。五结果处理1对标准溶液系列中的每一个标准溶液分别进行3

7、次分离，记录每次分离中TC、OTC、CTC各自的峰面积并求平均值，对该系列各自峰面积的平均值和浓度值进行线性回归，获得各自标准曲线方程Ai=ai+biCi中的ai和bi，其中i=1、2、3，代表TC、OTC、CTC。该项工作亦可利用仪器的功能在仪器上完成。2对测定的样品溶液分别进行3次分离，记录每次TC、OTC、CTC各自的峰面积并求平均值，将各值代入各自Ai=ai+biCi中，得到样品的结果。该项工作亦可利用仪器的功能在仪器上完成。六注意事项1分离要在基线稳定条件下进行，否则峰面积计算的准确性会受到影响。2色谱柱在测定结束后

8、要用纯甲醇清洗至少1h以上七结果处理牛奶加标品的液相色谱图三种抗生素混合标品的液相色谱图抗生素混合标品的液相色谱图(2和3号峰未分开)土霉素标品的液相色谱图八思考题1在牛奶中四环素类抗生素的提取过程中，加入EDTA的作用是什么？答：三种四环素都容易和金属离子螯合，而EDTA是